Um método visual sensível para a detecção de bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio

Resumo

Fonte: Zhu, W., & Chu, W. Método Visual Sensível para a Detecção de Bactérias Produtoras de Sulfeto de Hidrogênio. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra um método visual sensível para a detecção rápida de bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio. Uma mudança de cor de amarelo para preto indica atividade bacteriana através da formação de sulfeto de bismuto.

Protocolo

1. Cepas bacterianas

NOTA: Para este experimento, nove cepas padrão foram usadas, incluindo Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris e Klebsiella pneumoniae. Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa e Proteus vuigaris podem produzir H₂S.

1. Preparação da cultura bacteriana
   1. Transferir uma colónia bacteriana de Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 e Klebsiella pneumoniae de uma placa de ágar Luria-Bertani (LB) para 100 ml de meio LB e cultivar a 37 °C durante 12-16 h até que a concentração bacteriana seja de cerca de 1 x 10⁹ células/ml (conforme indicado pelo OD₆₀₀ = 1).
   2. Transferir uma colónia bacteriana de Fusobacterium nucleatum e Proteus vuigaris de placas de ágar tripticase de caldo de soja (TSB) para 100 ml de meio TSB e cultivar a 37 °C anaeróbia durante 24 h até que a concentração bacteriana seja de cerca de 1 x 10⁹ células/ml (conforme indicado por OD₆₀₀ = 1).

2. Ensaio de detecção H₂S

1. Teste de produção de sulfeto de hidrogênio
   1. Misture 100 μL de cultura bacteriana com 100 μL de solução de bismuto recém-preparada (pH 8,0; cloreto de bismuto (III) 10 mM, trietanolamina-HCl 0,4 M, 20 mM de piridoxal 5-fosfato monohidratado, 20 mM de EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) e 40 mM de L-cisteína) nas placas de microtitulação de 96 poços e cultive por 20 min a 37 ° C. Para cada cepa bacteriana, realizar a análise em triplicata.
   2. Após 20 min, verifique se há mudança de cor. Se a cor da solução mudar de amarelo claro para preto, isso indica que a bactéria é capaz de produzir H₂S. Repita esta medição 3x.
2. Sensibilidade do método
   1. Determinar a sensibilidade do método utilizando diferentes concentrações de hidrossulfureto de sódio (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e 0 mM, misturados com solução de BS (sulfureto de bismuto).
   2. Determine a presença de HS⁻/S²⁻ observando a formação de um precipitado BS preto. Pontue a cor dos poços usando uma escala visual de nenhuma produção de cor (-) até a produção de cor preta mais escura (++++++).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de bismuto (III)	Xangai Macklin Bioquímica Co., Ltd	7787-60-2
EDTA	Reagente químico Co. de Nanjing, Ltd	60-00-4
Fusobacterium nucleatum	ATCC	25586
L-cisteína	Amresco	52-90-4
Trietanolamina-HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	637-39-8
Hidrossulfeto de sódio
Pipeta