Preparação de um inóculo bacteriano unicelular

Resumo

Fonte: Niu, L., et al., Visualização da morte celular lítica de macrófagos durante infecção micobacteriana em embriões de peixe-zebra por meio de microscopia intravital. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a preparação de uma suspensão de célula única de Mycobacterium marinum a partir de uma cultura de fase logarítmica tardia para uso consistente em ensaios de infecção e aplicações a jusante.

Protocolo

1. Preparação de inóculo de célula única para Mycobacterium marinum (Figura 1)

1. Descongele o estoque de glicerol de Mycobacterium marinum fluorescente Cerulense a -80 ° C e inocule uma placa de ágar 7H10 com 10% (v / v) de OADC (ácido oleico, albumina, dextrose, catalase), 0,25% de glicerol e 50 μg / mL de higromicina. Incubar a placa a 32 °C durante cerca de 10 dias.
2. Selecione uma colônia que expresse fluorescência positiva e inocule 3 mL de meio 7H9 com 10% de OADC, 0,5% de glicerol e 50 μg/mL de higromicina.
   1. Incubar a inoculação a 32 °C e 100 rotações por minuto (rpm) durante 4-6 dias até que a cultura atinja a fase logarítmica (OD₆₀₀ = 0,6-1,0).
   2. Subcultura (1:100) em 30 mL de meio fresco 7H9 com 10% de OADC, 0,5% de glicerol, 0,05% de Tween-80 e 50 μg/mL até que o OD₆₀₀ atinja ~1,0.
      NOTA: Neste ponto, uma etapa de subcultura é recomendada para a mais alta qualidade da cultura. Em nossa experiência, adicionar o clone diretamente a um grande volume de meio levará à formação de aglomerados bacterianos.
3. Colete células de M. marinum conforme descrito abaixo.
   1. Centrifugue a 3.000 x g por 10 min para coletar o M. marinum como um pellet. Rejeitar tudo, exceto 300 μL do sobrenadante, e utilizá-lo para ressuspender o sedimento.
   2. Adicione 3 mL de meio 7H9 com 10% de glicerol para ressuspender ainda mais o pellet e, em seguida, sonicar a suspensão em banho-maria a 100 W a 15 s ON, 15 s OFF por um total de 2 min.
      NOTA: A sonicação é usada para obter um homogeneizado de célula única para o inóculo, o que evita que a agulha de microinjeção seja bloqueada.
4. Transfira a suspensão bacteriana para uma seringa de 10 ml e passe-a através de um filtro de 5 μm para remover grumos.
5. Meça a densidade óptica (DO) da suspensão usando um espectrofotômetro e dilua-a até OD₆₀₀ = 1,0 com meio 7H9 contendo 10% de glicerol. Divida a suspensão em alíquotas de 10 μL e armazene a -80 °C para uso futuro.
6. Confirmar a concentração bacteriana do inóculo (ufc/ml) por diluição seriada e plaqueamento do stock bacteriano numa placa de ágar 7H10 contendo 10% (v/v) de OADC, 0,5% de glicerol e 50 μg/ml de higromicina.

Resultados

Figura 1: Diagrama esquemático da preparação de bactérias de célula única. Estoques de Mycobacterium marinum fluorescente de Cerula de célula única foram gerados seguindo o processo descrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,05% Tween-80	Sigma	Pág. 1379
Seringa de 10 mL	Solarbio	YA0552
10% OADC	BD	211886
Filtro de 5 μm	Moinho X	SLSV025LS
50 μl/ml de higromicina	Sangon Biotech	A600230
7H10	BD	262710
7H9	BD	262310
Câmara Ambiental	Pecon	Controle de temperatura 37-2 digital
Microcarregador Eppendorf	Eppendorf	No.5242956003
Glicerol	Sangon Biotech	A100854
Incubadora	Quilha	PH-140 (A)
Mycobacterium marinum			ATCC BAA-535
Soniador	SCICNTZ	JY92-IIDN
Espectrofotômetro (OD600)	Eppendorf AG	22331 Hamburgo