Obtenção de amilóides citotóxicos após infecção bacteriana de células endoteliais pulmonares de ratos

Neste artigo

Resumo

Fonte: Balczon, R., et al. Métodos para detecção de amilóides citotóxicos após infecção de células endoteliais pulmonares por Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o procedimento para gerar sobrenadante citotóxico a partir de células endoteliais pulmonares após infecção por Pseudomonas aeruginosa. Ele descreve como as proteínas efetoras bacterianas interrompem a estrutura da célula hospedeira e induzem a liberação de oligômeros amilóides citotóxicos no sobrenadante.

Protocolo

Geração de sobrenadantes citotóxicos:

Culturas primárias de células endoteliais microvasculares pulmonares de ratos (PMVECs) foram obtidas do Cell Culture Core Facility do Centro de Biologia Pulmonar da Universidade do Sul do Alabama.

Para a geração de sobrenadantes citotóxicos, coloque 2 x 10⁶ células em placas individuais de 150 cm e cresça por 3 a 4 dias até que a confluência seja alcançada. Use duas placas por experimento.
Para produzir sobrenadante, lave um dos dois pratos de 150 cm de PMVECs com solução salina tamponada com fosfato, tripsinize e conte as células. Lave o outro prato de PMVECs com Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) e, em seguida, infecte com qualquer cepa de Pseudomonas aeruginosa em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20: 1. Isso é alcançado da seguinte forma:
1. Para P. aeruginosa, OD₅₄₀ 0,25 = 2 x 10⁸ UFC/mL. Para preparar esta diluição, adicione 1 mL de HBSS a uma cubeta descartável de 1 mL. Raspe bactérias suficientes da placa até que um OD₅₄₀ de 0,25 seja alcançado quando medido usando um espectrofotômetro. A próxima etapa fornecerá um cálculo de quanta bactéria será necessária.
2. Uma vez determinado o número de PMVECs na placa de cultura, determine o número apropriado de bactérias a serem adicionadas à segunda placa de cultura não tripsinizada contendo os PMVECs. Por exemplo, se for determinado que a placa de cultura de PMVECs contém 1,3 x 10⁷ células, prepare 1,3 x 10⁷ células x 20 bactérias/célula x 1 mL/2 x 10⁸ UFC = 1,3 mL de bactérias.
3. Dilua os 1,3 mL de bactérias em HBSS até um volume final de 20 mL, de modo que toda a superfície de um prato de 150 cm possa ser coberta com fluido e, em seguida, adicione as bactérias diluídas à placa de PMVECs.
4. Incubar os PMVECs inoculados com a bactéria a 37 °C em uma incubadora de CO₂a 5% por 4 a 5 h, até que as lacunas possam ser vistas se formando na monocamada celular quando a placa for observada microscopicamente (consulte a Figura 1 para o nível adequado de formação de lacunas).
5. Colete o sobrenadante e centrifugue por 10 min a 2.000 x g em uma centrífuga de mesa para remover os detritos celulares.
  Nota: Qualquer centrífuga de mesa capaz de gerar força g suficiente para granular células não lisadas e fragmentos de células grandes pode ser usada para esta etapa.
6. Despeje o sobrenadante em uma seringa que tenha um filtro de 0,2 μm conectado à sua extremidade e, em seguida, passe o sobrenadante pelo filtro para remover as bactérias.
7. Utilizar uma alíquota do sobrenadante estéril para testar a citotoxicidade e congelar o resto do sobrenadante a -80 °C para utilização futura.

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Resultados

Figura 1. Efeitos da inoculação de P. aeruginosa na morfologia do PMVEC. Uma monocamada confluente de PMVECs antes (A) e quatro horas após a adição (B) da cepa PA103 de P. aeruginosa. As lacunas podem ser vistas claramente na mono...