Introdução de um gene de interesse em uma célula é um método poderoso para elucidar a sua função in vivo. Este protocolo descreve um método eficiente de uma cultura de transfecting-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), utilizando o aparelho de eletroporação Nucleofector feita por Amaxa.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Transfecting células-tronco neurais com o Nucleofector Amaxa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Transfecção de células primárias de mamíferos neural, tais como tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), comumente usado com os reagentes de transfecção catiônicas lipídicas resultou muitas vezes na viabilidade celular pobres e eficiência de transfecção baixo. Outros métodos mecânicos de introduzir um gene de interesse, como uma arma gene ou microinjeção, também são limitados pela viabilidade celular pobres e baixos números de células transfectadas. A estratégia de usar construções viral para introduzir um gene exógeno em células primárias tem sido condicionada pela quantidade de tempo e trabalho necessário para criar vetores virais e preocupações de segurança em potencial. Descrevemos aqui um protocolo passo a passo para transfecting hNSPCs utilizando dispositivo Nucleofector Amaxa e tecnologia com os parâmetros elétricos atuais e soluções tampão especificamente otimizados para transfecting células-tronco neurais. Usando este protocolo, conseguimos a eficiência de transfecção inicial de ~ 35% e ~ 70% após transfecção estável. O protocolo envolve combinando um elevado número de hNSPCs com o DNA para ser transfectadas no buffer apropriada, seguida de eletroporação com o dispositivo Nucleofector.
Protocolo
Nota: Consulte o artigo Neural Stem Passaging Humanos Cells ( https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) ea Human Neural Stem Contando artigo Cells ( https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) para aprender a ressuspender e contar hNSPCs.
Preparação
- Certifique-se que há uma abundância de células disponíveis para transfecção (vários milhões de células para cada DNA a ser transfectadas).
- Revestimento de um prato de cultura de tecidos, no qual as células transfectadas serão distri....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este protocolo descreve um procedimento de transfecção relativamente rápida e eficiente para hNSPCs. Usando este procedimento, obtivemos a eficiência de transfecção inicial de ~ 35%. Células transfectadas por este procedimento pode ser usado para estudos de curto prazo (células transfectadas transitoriamente) ou para estudos de longo prazo se um agente de seleção é usado para gerar uma população estável transfectadas. Geramos células transfectadas estavelmente em que ~ 70% das células expressam a proteína exógena. Em hNSPCs transitoriamente.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional do Hospital Infantil s, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de culturas hNSPC.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| O Dispositivo Nucleofector | Ferramenta | Amaxa | AAD-1001 | |
| Kit Nucleofector para células-tronco neurais de camundongo | Reagente | Amaxa | VPG-1004 |
Referências
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
