Rastreando a dinâmica da infecção bacteriana em um camundongo usando bioluminescência

Resumo

Fonte: Valentine, M. E., et al. Geração de mutantes de deleção de genes em Pseudomonas aeruginosa e teste de atenuação de virulência em um modelo simples de infecção em camundongos. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o uso da bioluminescência para visualizar e comparar o comportamento in vivo de cepas bacterianas virulentas e atenuadas em camundongos. Ele descreve a preparação de suspensões bacterianas bioluminescentes e sua injeção intraperitoneal em camundongos. A cepa virulenta exibe disseminação sistêmica, enquanto a cepa atenuada permanece localizada e é gradualmente eliminada, conforme indicado pelo sinal de desvanecimento.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Inoculação de animais com cepas bacterianas por injeção
   1. Na manhã das injeções, remova os criotubos das cepas bacterianas que estão sendo testadas e descongele a 4 ° C por 3-4 h. Descongele 0,5 mL para cada camundongo que será injetado. Mantenha os frascos no gelo após o descongelamento e injete os camundongos dentro de 2 h.
   2. Após o descongelamento, transfira cada criogenia para um novo tubo de 2 mL e centrifugue a 4.500 x g por 10 min, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato).
   3. Centrifugue novamente a 4.500 x g por 10 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1x PBS até uma concentração final de 2,5 x 10⁹ UFC / mL (UFC: unidades formadoras de colônias). A quantidade exata de 1x PBS usada varia ligeiramente entre as cepas.
      1. Colher 3 amostras da suspensão final de cada estirpe para validar UFC/ml, genótipo e fenótipo conforme descrito acima.
   4. Para cada cepa, alíquota de 1,5 mL de PBS/suspensão celular em um tubo de 2 mL por 5 camundongos para limitar o número de vezes que o tubo é inserido. Além disso, prepare tubos de 1x PBS para injeções de controle.
   5. Reúna camundongos (10 machos e 10 fêmeas C57BL / 6 por grupo para este experimento) e materiais necessários para injeções (seringas, agulhas, recipientes para objetos cortantes, marcadores, caneta e papel, etc.). Vá para a sala cirúrgica de animais estéreis. Limpe todas as superfícies com lenços desinfetantes.
      1. Para eliminar o sofrimento e o risco de ferimentos ao experimentador, traga apenas um sexo e um grupo experimental de camundongos para a sala cirúrgica de cada vez (por exemplo, um grupo de 10 camundongos machos infectados com uma cepa específica). Use dois pares de luvas de látex para eliminar a perfuração das luvas se for mordido. Use jaleco, óculos de segurança e máscara facial para evitar contaminação.
   6. Comece as injeções do grupo de controle com 1x PBS. Isso verificará se algum efeito adverso resulta apenas da injeção.
      1. Remova um rato da gaiola. Remova apenas um mouse de cada vez.
      2. Pese o mouse e marque sua cauda com um marcador permanente para rastrear a perda de peso após a injeção.
      3. Abra uma nova seringa de 1 mL e uma agulha de 27 G (use uma nova seringa e agulha para cada camundongo para eliminar a contaminação) e injete 200 μL de PBS 1x estéril.
         1. Pegue o mouse atrás das orelhas usando o polegar e o indicador. Aperte para criar a dobra da pele na nuca para segurar - uma dobra mais apertada reduz o movimento do pescoço e o risco de ser mordido durante a injeção. Prenda a cauda na palma da mão usando o mindinho para segurar o mouse plano com pouco movimento.
         2. Vire o mouse e insira a agulha em um ângulo de 30° na cavidade peritoneal no lado esquerdo ou direito da linha média. Levante ligeiramente a agulha depois de inserida para garantir que ela foi inserida na área intraperitoneal e não nos órgãos. Injete lentamente o PBS e retire a agulha.
         3. Coloque a agulha usada em um recipiente designado para objetos cortantes de risco biológico. Não reutilize a seringa ou a agulha. Um bolus no local da injeção é típico.
      4. Após a injeção, mova o mouse para uma gaiola separada.
      5. Repita o procedimento com o próximo mouse. Depois que todos os camundongos de uma gaiola forem injetados, devolva-os à gaiola original imediatamente.
   7. Depois de injetar o grupo de controle, comece a injetar suspensões de cepas a serem testadas seguindo o mesmo procedimento.
      1. Injetar 200 μL da suspensão celular. Ao começar com suspensões celulares de 2,5 x 10⁹ UFC/mL, cada camundongo recebe 5 x 10⁸ UFC.
         NOTA: Essas concentrações foram otimizadas com pesquisas preliminares em animais para determinar as doses letais de cada cepa. A dosagem pode precisar ser ajustada para outras cepas/espécies.
   8. Quando todas as injeções estiverem concluídas, devolva os camundongos à sala de alojamento para aliviar o sofrimento. Limpe a área de trabalho com lenços desinfetantes.
   9. Monitorizar a mortalidade dos animais após a injeção, verificando a existência de ratinhos mortos em gaiolas a cada 3 h durante 72 h e a cada 12 h durante 10 dias. Registre o peso dos ratos a cada 12 h para determinar a perda de peso devido a doenças.

Materiais