Gerando recombinantes de cruzamento duplo de Pseudomonas aeruginosa para deleção de genes direcionados

Resumo

Fonte: Valentine, M. E., et al. Geração de mutantes de deleção de genes em Pseudomonas aeruginosa e teste de atenuação de virulência em um modelo simples de infecção em camundongos. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra a geração de recombinantes de cruzamento duplo em Pseudomonas aeruginosa usando uma estratégia de deleção de genes baseada em plasmídeo. O processo envolve a seleção de bactérias que abrigam um plasmídeo não replicativo integrado ao genoma por meio de um único cruzamento e, em seguida, a indução de um segundo evento de recombinação sob seleção de sacarose para extirpar o plasmídeo. A recombinação cruzada dupla bem-sucedida é confirmada pela perda de resistência a antibióticos e pela capacidade de crescer em meios contendo sacarose.

Protocolo

1. Detecção de recombinantes cruzados duplos de P. aeruginosa

1. Para cada cultura em caldo, inocular 10 μL de cultura em uma placa pré-aquecida de PIA (Pseudomonas Isolation Agar) suplementada com sacarose a 10% (sem glicerol) e estria para colônias isoladas. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
2. No dia seguinte, remova as placas da incubadora e inspecione-as quanto ao crescimento. As colônias resistentes à sacarose devem ser recombinantes de cruzamento duplo (ou seja, ter removido o plasmídeo do cromossomo por meio de um evento de recombinação entre a outra região homóloga da inserção do plasmídeo e o cromossomo P. aeruginosa ).
   1. Coloque pelo menos 20 colônias com palitos de dente estéreis em placas pré-aquecidas de: 1) PIA, 2) PIA suplementado com sacarose a 10% (sem glicerol) e 3) PIA suplementado com 300 μg / mL de carbenicilina.
3. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
4. Remova as placas da incubadora e examine-as quanto ao crescimento. Os verdadeiros recombinantes de cruzamento duplo serão sensíveis à carbenicilina e resistentes à sacarose (ou seja, colônias que cresceram em PIA e PIA suplementadas com sacarose, mas não cresceram em PIA suplementada com carbenicilina).

Materiais