Preparação e isolamento de esporos de Streptomyces venezuelae de uma cultura líquida

Resumo

Fonte: Schlimpert, S., et al. Imagem de lapso de tempo de fluorescência do ciclo de vida completo de S. venezuelae usando um dispositivo microfluídico. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o cultivo e isolamento de esporos de Streptomyces venezuelae. Os esporos, células dormentes que ajudam as bactérias a sobreviver ao estresse, são produzidos durante a limitação de nutrientes e coletados por centrifugação. O método garante uma suspensão de esporos pura e armazenada a frio para aplicações a jusante.

Protocolo

1. Isolamento de esporos frescos de Streptomyces venezuelae e preparação do meio de cultura gasto

1. Inocular 30 ml de meio de extrato de malte de maltose-levedura, suplementado com 60 μl de solução de oligoelemento R2 (TE), com 10 μl de esporos da estirpe SV60 [attBφBT1::p SS209 (PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)]. Para um crescimento consistente e esporulação das células, use um frasco defletor ou um frasco que contenha uma mola para permitir aeração suficiente.
2. Cultivar células durante 35-40 horas a 30 °C e 250 rpm.
3. Examinar as células por microscopia de contraste de fase montada em líquido. Neste ponto, fragmentos e esporos miceliais serão visíveis.
4. Centrifugue 1 ml de células em uma centrífuga de mesa a 400 x g por 1 minuto para granular o micélio e fragmentos de células maiores.
5. Transferir cerca de 300 μl de sobrenadante contendo uma suspensão de esporos para um novo tubo de 1,5 ml e manter em gelo. Manter o meio de cultura restante
6. Dilua os esporos 1:20 em MYM-TE (concentração final: 0,5-5 x 10⁷ esporos / ml) e mantenha no gelo até que seja necessário.
   NOTA: Embora as condições exatas que desencadeiam a esporulação em Streptomyces não sejam compreendidas, o uso de meio MYM-TE gasto, incluindo quaisquer sinais extracelulares desconhecidos de uma cultura esporulante, estimula a esporulação.
7. Filtre-esterilize 10 ml do meio de cultura restante para obter MYM-TE gasto que esteja livre de esporos e fragmentos miceliais. Use um filtro de seringa estéril de 0,22 μm e transfira o MYM-TE gasto para um tubo estéril de 15 ml.
8. Manter o MYM-TE gasto preparado durante alguns dias a 4 °C se forem realizadas experiências adicionais utilizando condições de crescimento semelhantes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Maltose-Yeast Extract - Malt Extract (MYM)4 g de maltose4 g de extracto de levedura10 g de extracto de malteadicionar 1 L H2O com 50 % de água da torneira e 50 % de água de osmose inversa e suplementar com 200 ml de solução de oligoelementos R2 por 100 ml após autoclave			Meio de esporulação utilizado para cultura de Streptomyces venezuelae SV60
R2 Solução de oligoelementos (TE)8 mg ZnCl240 mg FeCl3-6H 2O2 mg CuCl2-2H 2O2 mg MnCl2-4H 2O2 mg Na2B4O7-10H 2O2 mg (NH4)6Mo7O24-4H 2Oadd 200 ml H2OAutoclave e conservar a 4 °C			Adicionar volumes 0,002 ao MYM
PBS (solução salina tamponada com fosfato)	Sigma	P4417-100TAB	Usado para reabastecer poços de entrada de pistas não utilizadas em placas B04A, a fim de preparar a placa para armazenamento de curto prazo.
Filtros de seringa de 0,22 μm	Satorius stedim	16532-K	Preparação de MYM-TE gasto