Imagem de lapso de tempo de fluorescência do ciclo de vida de Streptomyces venezuelae

Resumo

Fonte: Schlimpert, S. et al. Imagem de lapso de tempo de fluorescência do ciclo de vida completo de S. venezuelae usando um dispositivo microfluídico. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra imagens de lapso de tempo de fluorescência do ciclo de vida completo da bactéria Streptomyces venezuelae usando um dispositivo microfluídico para visualizar a germinação, o crescimento das hifas e a esporulação em tempo real.

Protocolo

1. Configuração do microscópio e do protocolo de lapso de tempo

Nota: Este método foi implementado em um microscópio de campo amplo invertido totalmente motorizado e automatizado equipado com uma câmera sCMOS, uma lâmpada de iodetos metálicos, um foco automático de hardware, um suporte de platina para placas de 96 poços e uma câmara ambiental.

1. Pré-aqueça a câmara ambiental a 30 °C com antecedência para evitar problemas com o foco automático após iniciar o experimento. O tempo necessário depende da câmara ambiental utilizada, do microscópio e do sistema de aquecimento. Comece a aquecer o sistema na noite anterior ao experimento.
2. Ligue o microscópio e o software de automação e controle de microscopia. Use uma objetiva de imersão em óleo de alta abertura numérica (NA) para coleta de sinal e resolução espacial ideais, como uma objetiva DIC de óleo de 100X e 1,46 NA. Selecione filtros e espelhos dicromáticos apropriados para adquirir imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) e imagens de fusões de proteínas amarelo-fluorescentes e vermelho-fluorescentes.
3. Coloque uma gota de óleo de imersão na objetiva e adicione fluido de imersão na parte inferior da janela de imagem na placa microfluídica para melhorar o foco da célula durante a aquisição da imagem. Monte cuidadosamente o dispositivo microfluídico selado no stage do microscópio invertido. Certifique-se de que a placa esteja bem colocada no suporte do estágio e não se desloque ao longo do experimento.
4. Traga a janela de imagem da câmara de cultura microfluídica em foco usando os marcadores de posição embutidos para orientação. Concentre-se na parte mais à esquerda da primeira câmara de fluxo (rotulada como "A") com o tamanho do purgador 5, correspondendo a uma altura do purgador de 0,7 μm.
5. No software de microfluídica, carregue as células do poço de entrada 8 a 4 psi por 15 segundos. Verifique a densidade celular na câmara de cultura movendo a platina pela janela de imagem. Se nenhum esporo estiver preso, repita a etapa de carregamento celular ou, alternativamente, aumente a pressão e/ou o tempo de carregamento até que a densidade celular desejada seja alcançada (1-10 esporos por janela de imagem com 2.048 x 2.048 pixels). Evite sobrecarregar a câmara de cultura. Nota: Normalmente usamos o tamanho da armadilha 5 para imagens de Streptomyces, mas também obtivemos bons resultados com os tamanhos de armadilha 4 e 3.
6. Inicie o programa de fluxo no software de controle e permita que a placa microfluídica se equilibre por 1 hora no estágio de microscópio antes de iniciar a aquisição da imagem.
7. No software de controle do microscópio, configure uma aquisição multidimensional para obter várias imagens em várias posições de estágio ao longo do tempo:
   1. Para Salvamento automático: especifique um diretório para salvar automaticamente os arquivos de imagem.
   2. Para configurações de iluminação, determine as configurações de iluminação ideais para cada construção específica com antecedência. Para o experimento descrito, use os seguintes tempos de exposição: DIC 150 ms, YFP 250 ms, RFP 100 ms.
   3. Para séries temporais: configure uma série temporal para adquirir imagens nos pontos de tempo desejados em sequência. Para obter imagens do ciclo de vida de S. venezuelae, selecione um intervalo de tempo de 40 minutos em um período de 24 horas.
   4. Para posições de platina e foco automático: escaneie a câmara de cultura movendo a platina e armazene as posições da platina para cada posição de imagem de interesse. Certifique-se de que as posições de estágio único estejam localizadas suficientemente afastadas para minimizar o fotobranqueamento e a fototoxicidade. Normalmente, use até 12 posições. Execute a rotina de foco automático para cada ponto de tempo para corrigir o desvio focal lento. Se disponível no software de controle do microscópio, defina a estratégia de foco automático como "atualização de superfície local por foco automático de hardware". Depois que as coordenadas Z das posições do palco selecionadas forem verificadas, ative o foco automático do hardware.
8. Inicie o experimento de lapso de tempo no software de controle do microscópio.
9. Verifique se todas as posições do palco ainda estão em foco em pontos posteriores. Para experimentos de lapso de tempo executados por várias horas, ocasionalmente observamos um desvio de estágio, mesmo ao usar o foco automático. Se as posições do palco precisarem ser refocadas, pare o experimento em um ponto de tempo apropriado, ajuste o foco e reinicie o experimento dentro do intervalo de tempo de imagem definido.
10. Interrompa a aquisição de imagens após 24-30 horas ou quando as hifas na região de interesse se diferenciarem em esporos. Em seguida, pare o programa de fluxo no software e desmonte o dispositivo microfluídico.
11. Prepare a placa microfluídica usada para armazenamento de curto prazo. Remova o meio restante do poço 1 a 6, esvazie o poço de resíduos 7 e o poço de carregamento de células 8. Em condições estéreis, reabasteça os poços usados da pista "A" e os poços das pistas não utilizadas ("B" a "D") na placa com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). Selar a placa com parafilme para evitar que seque e conservar a 4 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
B04A CellAsic ONIX placa para células bacterianas	Merck-Millipore	B04A-03-5PK	Placas de cultura microfluídica
Sistema de Perfusão Microfluídica CellAsic ONIX e ONIX FG (versão 5.0.2)	Merck-Millipore	EV-262	A versão mais recente do ONIX (julho de 2015) e as instruções sobre como usar o programa podem ser encontradas aqui: http://www.merckmillipore.com
Microscópio Axio Observer.Z1	Zeiss	431007-9902-000	Microscópio de campo amplo invertido totalmente automatizado e motorizado
Incubadora XL multi S1 com Módulo de Temperatura S1 e Unidade de Aquecimento XL S2	Zeiss	411857-9061-000	Câmara ambiental ao redor do microscópio
Objetiva Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC	Zeiss	420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2	Hamamatsu Photonics K.K.	C11440-22CU
Iluminador HXP 120V	Zeiss	423013-9010-000
Conjunto de filtros FL 46 HE YFP shift free	Zeiss	489046-9901-000	Conjunto de filtros fluorescentes, excitação 500/25 nm, emissão 535/30 nm
Conjunto de filtros FL 63 HE RFP sem turnos	Zeiss	489063-0000-000	Conjunto de filtros fluorescentes, excitação 572/25 nm, emissão 629/30 nm
Estrutura de montagem K-M para placas multipoços	Zeiss	000000-1272-644	Suporte de palco para placa microfluídica
ZEN pro 2012	Zeiss	410135-1002-120	Software de controle de microscópio
Lapso de tempo do módulo ZEN	Zeiss	410136-1031-110	Módulo de software para configurar experimentos de microscopia de lapso de tempo
Mosaicos/posições do módulo ZEN	Zeiss	410136-1025-110	Módulo de software para salvar posições específicas do palco (xzy)
Fiji	Pacote de software de código aberto	http://fiji.sc/Fiji	Geração de filmes time-lapse
PBS (solução salina tamponada com fosfato)	Sigma	P4417-100TAB	Usado para reabastecer poços de entrada de pistas não utilizadas em placas B04A, a fim de preparar a placa para armazenamento de curto prazo.
SV60	Coleção de cepas John Innes Centre		Cepa de S. venezuelae expressando divIVA-mcherry e ftsZ-ypet