Comportamento de enxameação de Pseudomonas aeruginosa sob estresse antibiótico

Resumo

Fonte: Bru, J., et al., Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o procedimento para analisar o comportamento de enxameação de Pseudomonas aeruginosa , observando o crescimento bacteriano de uma cultura central em direção a pontos satélites contendo a mesma cultura misturada com um antibiótico, usando uma configuração de placa de ágar e imagens de lapso de tempo.

Protocolo

1. Crescimento de P. aeruginosa e condições de plaqueamento

1. Prepare 400 mL de caldo de lisogenia (LB) adicionando 10 g de mistura de pó LB-Miller a 400 mL de ddH₂O. Adicione mais 8 g de ágar para placas de Petri de 2% de LB-ágar. Autoclave para esterilizar.
2. Despeje 20 mL de meio LB-ágar fundido em placas de Petri de 10 cm de diâmetro e deixe-as solidificar à temperatura ambiente durante a noite. Conservar o meio líquido à temperatura ambiente e as placas de ágar-ágar a 4 °C.
3. Risque P. aeruginosa em uma placa de Petri LB-agar de um estoque congelado armazenado a -80 ° C usando alças estéreis ou varas de madeira. Incubar a placa de Petri de cabeça para baixo durante a noite a 37 °C. Conservar a placa de ágar-LB a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.
4. Escolha uma única colônia da placa de Petri com uma alça estéril ou vara de madeira, inocule-a em meio LB de 2 mL e incube a cultura até a saturação durante a noite (16–18 h) a 37 ° C em um tambor de rolo ajustado a 100 rpm.
5. Pipetar 5 μL de cultura durante a noite da etapa 1.4 usando uma pipeta P20 e local no centro da placa de ágar de enxame, aproximando-se da ponta da pipeta em um ângulo (10–45 °) 2,5 cm acima da área de spotting, pipetando até a primeira parada e tocando o ágar apenas com a gota de líquido (Figura 1B).
   1. Evite tocar no ágar-ágar com a ponta da pipeta, pois isso pode danificar o ágar. Use um modelo para posicionar o local de forma consistente em diferentes placas de ágar enxame.
6. Para tratamentos com antibióticos, misture 30 μL de cultura noturna de P. aeruginosa da etapa 1.4 com 6 μL de 3 mg / mL de gentamicina, 10 μL de 100 mg / mL de canamicina ou 7,5 μL de 100 mg / mL de fosfomicina. Prossiga imediatamente para a próxima etapa.
   1. Pipetar 6 μL de P. aeruginosa tratada com antibiótico usando uma pipeta P20 e manchar em 6 posições satélites equidistantes em um círculo concêntrico de raio de 2,8 cm em torno do centro do prato, aproximando-se da ponta da pipeta em um ângulo (10 a 45°) 2,5 cm acima da área de mancha, pipetando até a primeira parada, e tocar o ágar-ágar apenas com a gota líquida (Figura 1D).
   2. Evite tocar no ágar-ágar com a ponta da pipeta, pois isso pode danificá-lo. Use um modelo de revestimento para consistência.
7. Substitua as tampas transparentes da placa de Petri por tampas pretas (Figura 2A).
8. Coloque as placas de ágar-enxame em um scanner em uma incubadora ajustada a 37 ° C com banho-maria de 10 L para manter 75% de umidade (Figura 1E, Figura 2B). CUIDADO: Não perturbe as células manchadas nas placas de ágar em enxame. Mantenha os pratos sempre voltados para cima.

Resultados

Figura 1: Esquema do ensaio de enxame de P. aeruginosa e resposta coletiva ao estresse. (A) As células de P. aeruginosa são cultivadas durante a noite (16–18 h a OD₆₀₀

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
Ágar bacto, desidratado	BD Difco	214010	Para placa de ágar LB e placa de ágar de enxame
Ácidos de Casamino	BD Difco	223050	Para enxame de mídia
D-glicose	Fisher Química	D16500	Dextrose. Para enxame de mídia
Sal dissódico de fosfomicina	Indústria Química de Tóquio	F0889	Concentração de estoque: 200 mg / mL. Dissolvido em ddH₂O
Sulfato de gentamicina	Sigma-Aldrich	G1914	Concentração de estoque: 3 mg / mL. Dissolvido em ddH₂O
Sulfato de canamicina	Sigma-Aldrich	60615	Concentração de estoque: 100 mg / mL. Dissolvido em ddH₂O
LB-Miller	BD Difco	244620	Para caldo LB e placas de ágar LB
Sulfato de magnésio heptahidratado	Sigma-Aldrich	230391	Para enxame de mídia
Cepas
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn laboratório	AFS27E.118	Cepa PA14
Suprimentos
Lixa de óxido de alumínio	3M	150 Multa	Para tampas pretas
Tecido preto	Joann	PRD7089	Tecido preto
Tinta spray preta	Krylon	5592 Preto fosco	Para tampas pretas
Erlenmeyer	Kimax	26500	250 mL
Garrafas de armazenamento de vidro	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
8 polegadas de braçadeiras	Gardner Bender	E173770	Para fixar tecido preto fosco
Placas de Petri (100 mm x 15 mm)	Pescador	FB0875712	Placas de poliestireno 100 x 15 mm
Varas de madeira	Pescador	23-400-102	Para estriar e inocular bactérias
Equipamento
Autoclave	Mercado Forge Indústrias	STM-E	Para esterilizar reagentes
Pipeta de 25 mL	EUA Scientific, Inc.	1072-5410	Para pipetar 20 mL para placas de ágar enxameadas
Desumidificador	Frigorífico	FAD704DWD 70 litros	Para manter a umidade relativa da sala em cerca de 45%
Incubadora	VWR	89032-092	Para o crescimento de bactérias a 37 °C
Banho-maria Isotemp	Pescador	15-462-21Q	Para fluidos de resfriamento a 55 °C
Capa de fluxo laminar	A Companhia Baker	SG603A	Para placas de secagem
Pipeta P-20	Gilson	F123601	Manchas em placas de ágar enxame
Controlador de pipetas	Tecnologia de marca	Accu-Jet	Para pipetar 20 mL para placas de ágar enxameadas