Indução da diferenciação de Vibrio parahaemolyticus em células de enxame

Resumo

Fonte: Heering, J., et al. Indução de diferenciação celular e imagem de célula única de células nadadoras e enxameadoras de Vibrio parahaemolyticus . J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a indução da diferenciação de células de enxame em Vibrio parahaemolyticus usando um meio de ágar especialmente preparado. Ao manipular pistas ambientais, como depleção de ferro, suplementação de cálcio e contato com a superfície, as bactérias são estimuladas a fazer a transição de sua forma de nadador para células de enxame alongadas com flagelos laterais. Essas células diferenciadas se espalham pela superfície sólida, formando enxames característicos que significam uma mudança morfológica bem-sucedida.

Protocolo

1. Indução da diferenciação de células de enxame

NOTA: As etapas a seguir descrevem como induzir a diferenciação de V. parahaemolyticus em seu ciclo de vida de células mais enxameadas e como estimular a proliferação em superfícies sólidas.

1. Suspenda 4 g de ágar Heart Infusion (HI) em 100 mL ddH₂O para preparar as placas de enxameação.

2. Ferva cuidadosamente a solução de ágar HI no micro-ondas e agite o frasco de vez em quando até que o pó se dissolva. Autoclave a 121 °C por 20 min.

3. Após a autoclavagem, arrefecer o ágar HI a 60-65 °C. Adicionar 2,2'-bipiridil a uma concentração final de 50 μM (solução reserva de 50 mM em etanol a 100%). Adicionar CaCl₂ a uma concentração final de 4 mM (solução reserva de 4 M em ddH₂O). Se necessário, adicione antibióticos à solução para manter os plasmídeos.

NOTA: Se planear utilizar um plasmídeo induzível, adicionar um agente indutor à sua concentração final.

CUIDADO: 2,2'-Bipiridil: Toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação). Use luvas e óculos de segurança ao manusear este produto químico.

4. Despeje 30 - 35 mL da solução final de ágar HI em uma placa de Petri redonda de 150 mm e deixe o ágar solidificar.

5. Imediatamente antes de detectar a cultura de células, seque a placa de ágar a 37 °C por pelo menos 10 min (ou até que quaisquer resíduos líquidos tenham desaparecido, mas não mais) na vertical com a tampa aberta.
NOTA: Os tempos de secagem dependem muito da incubadora usada e as placas muito secas não permitem a enxameação de V. parahaemolyticus. (Esta etapa é muito importante!) As placas devem ser usadas frescas e não devem ter mais de 2 a 3 h. Placas velhas estarão muito secas para estimular o enxame.

6. Inocule uma pequena quantidade de células da borda de uma única colônia em 5 mL de caldo Luria-Bertani (LB). Incubar a cultura agitando a 37 °C até que OD₆₀₀ = 0,8 seja alcançado, geralmente leva cerca de 2-3 horas. Depois disso, as células estão prontas para serem vistas em placas de ágar HI.

7. Localize 1 μL de cultura de células no centro de uma placa de enxame de ágar HI (Figura 1A).

8. Deixe o local secar (Figura 1B).

9. Sele a placa com fita plástica transparente e certifique-se de que esteja firmemente presa, caso contrário, ela pode se soltar durante a incubação durante a noite (Figura 1C).

NOTA: É muito importante que a vedação seja perfeita. Evite a formação de bolhas de ar e dobras na fita quando ela for aplicada.

10. Incube a placa a 24 °C durante a noite. Isso resultará na formação de uma colônia de enxame de V. parahaemolyticus com chamas de enxame que se estendem da periferia da colônia de enxame (Figura 2).

Resultados

Figura 1: Indução de diferenciação de enxame e preparação de células para imagens de microscopia. Visualização simplificada do fluxo de trabalho para produzir células de enxame de V. parahaemolyticus e a preparação de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Componentes de mídia
LB médio	Roth	X968.3
Ágar Difco, granulado	BD	214510	Para preparação de ágar LB com meio LB
Ágar Infusão Cardíaca Difco	BD	244400	Para preparação de placas de enxame de ágar HI
Agarose NEEO, ultra qualidade	Roth	2267.3	Para preparação de almofadas de agarose de microscopia
Aditivos
2,2'-Bipiridil	Sigma Aldrich	D216305-25G	Para preparação de placas de enxame de ágar HI
Cloreto de cálcio di-hidratado	Roth	5239.1	Para preparação de placas de enxame de ágar HI
Hardware
Placa de Petri 150 mm x 20 mm com cames	Sarstedt	82.1184.500	Para preparação de placas de enxame de ágar HI
kelvitron t (B 6420)	Heraeus	-	Usado para secar placas de enxame de ágar HI