Monitoramento da infecção bacteriana e entrega de proteínas efetoras em células vegetais

Resumo

Fonte: Lee, H. et. al., Sistema de proteína fluorescente verde dividida para visualizar efetores entregues por bactérias durante a infecção. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra um método para monitorar a infecção bacteriana e a entrega de proteínas efetoras em células vegetais usando a complementação de proteína fluorescente verde de superpasta dividida (sfGFP) combinada com microscopia confocal. A abordagem permite a visualização precisa da translocação efetora para o citosol da célula hospedeira.

Protocolo

NOTA: Todas as etapas são executadas em temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.

1. Preparação de materiais vegetais (4 semanas)

1. Preparação para as plantas Nicotiana benthamiana
   1. Semeie 2 sementes de N. benthamiana na superfície do solo de cada vaso, cubra a bandeja com uma cúpula de plástico e deixe as sementes germinarem em uma câmara de crescimento de 25 °C, 60% de umidade com um ciclo de fotoperíodo claro/escuro de 16/8 h.
   2. Após duas semanas, escolha e descarte a menor muda em cada vaso. Continuar a cultivar plantas nas mesmas condições de crescimento aplicadas para germinação na etapa 1.1.1. Adicione 1 L de água por bandeja a cada dois dias.
      NOTA: As condições de crescimento das plantas podem variar entre os laboratórios. Portanto, siga o protocolo regular de rega para cultivar a planta em condições saudáveis.
   3. Em uma semana, transfira as plantas para uma nova bandeja e arrume-as com espaço adequado para crescimento posterior. Continue cultivando as plantas nas condições descritas na etapa 1.1.1 até que estejam prontas para serem infiltradas às 4 semanas de idade.
      NOTA: O crescimento das plantas pode diferir dependendo das condições de crescimento entre os laboratórios. Normalmente, descobrimos que as plantas de N. benthamiana com 4 semanas de idade têm cerca de seis folhas.
2. Preparação para plantas transgênicas Arabidopsis thaliana
   1. Consulte a Tabela de Materiais e encomende as sementes transgênicas de Arabidopsis .
   2. Mergulhe ~ 50 - 100 sementes transgênicas de Arabidopsis em 1 mL de água destilada e armazene-as a 4 ° C por 3 dias no escuro para sincronizar o início da germinação.
   3. Semeie ~ 2 - 3 sementes na superfície do solo de uma bandeja de plantas em forma de tampão e cubra a bandeja com uma cúpula de plástico. Deixe as sementes germinarem a 23 °C, 60% de umidade com um ciclo de fotoperíodo claro/escuro de 10/14 h.
      NOTA: As sementes devem ser homozigóticas. No entanto, recomendamos reconfirmar a presença do transgene no lote. Neste caso, esterilize as sementes lavando com etanol 70% por 2 min, água sanitária 50% (cerca de 2% hipoclorito) contendo 0,05% Triton X-100 por 5 min. Seguido de lavagem 5 a 6 vezes com água bidestilada estéril (ddH₂O). Após a esterilização, estratificar a 4 °C por 3 dias e semeá-los em meio de germinação de plantas contendo 25 μg/L de higromicina B para selecionar as plantas transgênicas.
   4. Após uma semana, deixe apenas uma planta por plugue e continue cultivando plantas nas mesmas condições de crescimento usadas para a etapa 1.2.3.
      NOTA: Plantas com quatro semanas de idade foram usadas para a infecção por Pseudomonas syringae . Regue as plantas em dias alternados para mantê-las saudáveis.

2. Preparação da cultura de Pseudomonas (~ 1 semana)

1. Construção do plasmídeo para transformação de Pseudomonas
   1. Consulte a Tabela de Materiais e solicite o(s) vetor(es) desejado(s) do vetor do sistema de entrega de efetores baseado no sistema de secreção tipo III (T3SS).
   2. Insira o gene efetor de interesse no vetor de entrega do efetor usando clonagem de recombinação específica do local.
      NOTA: Ao monitorar a localização subcelular da proteína efetora de comprimento total, coloque o gene de comprimento total em pBK-GW-1-2 ou pBG-GW-1-2. Também é possível escolher pBK-GW-1-4 ou pBG-GW-1-4 contendo 2x sfGFP11 (11ª fita β de sfGFP) para aumentar o sinal de fluorescência. No caso de um efetor parcial sem um peptídeo sinal, use pBK-GW-2-2 ou pBK-GW-2-4.
2. Transforme o plasmídeo que carrega um efetor fundido à marca sfGFP11 para P. syringae pv. O tomate (Pst) CUCPB5500 usando eletroporação padrão.
   NOTA: Outras cepas de Pseudomonas podem ser usadas, se necessário. O sistema de marcação sfGFP11 é construído para uma ampla gama de vetores, e a expressão gênica do efetor é regulada pelo promotor AvrRpm1, que é comparável com, por exemplo, Pseudomonas fluorescens (EthAn).
3. Espalhe as células bacterianas transformadas suavemente sobre a superfície das placas de ágar King's B contendo 100 μg / mL de rifampicina e 25 μg / mL de canamicina ou 25 μg / mL de gentamicina. Incubar a 28 °C durante 2 dias.
4. Inocular uma colónia em meio líquido King's B com antibióticos adequados ao vector utilizado e cultivar as células durante a noite a 28 °C com agitação a 200 rpm.
5. Faça um caldo de glicerol. Adicione glicerol autoclavado a uma concentração final de 50% e armazene a -80 °C.

3. Expressão transitória de sfGFP1-10^OPT direcionado a organelas (1-^10ª fita β de sfGFP) em N. benthamiana (4 dias)

1. Preparação da cultura de Agrobacterium
   1. Encomende o(s) vetor(es) desejado(s) do(s) plasmídeo(s) sfGFP1-10^OPT direcionado(s) a organela (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Transforme o(s) plasmídeo(s) em células de Agrobacterium tumefaciens da cepa GV3101. Cultive as células em meio de ágar Luria-Bertani (LB) suplementado com 50 μg / mL de canamicina e 50 μg / mL de rifampicina a 28 ° C por 2 dias.
   3. A partir de uma única colônia no meio de ágar LB, inocular as células em 5 mL de meio LB líquido suplementado com 50 μg / mL de canamicina e 50 μg / mL de rifampicina. Cultive as células durante a noite a 28 °C com agitação a 200 rpm.
   4. Colha as células por centrifugação a 3.000 x g por 10 min. Despeje o meio sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão de infiltração recém-feito.
   5. Meça a quantidade de Agrobacterium obtendo o valor da densidade óptica (OD) a uma absorbância de 600 nm (Abs 600 nm). Ajuste o OD₆₀₀ da bactéria para 0,5 com tampão de infiltração.
      NOTA: 1 mL de suspensão é suficiente para se infiltrar em dois pontos.
   6. Deixe a cultura em temperatura ambiente em um balancim suave por 1 a 5 h antes da infiltração.
   7. Faça um buraco no centro das folhas a serem infiltradas com uma ponta de 10 μL. Use uma seringa sem agulha de 1 mL para infiltrar as suspensões de Agrobacterium . Injetar cuidadosa e lentamente cerca de 500 μL das suspensões preparadas a partir do passo 3.1.5 no lado adaxial da folha através da seringa. Repetir a infiltração em, pelo menos, três plantas diferentes para réplicas experimentais.
      NOTA: Por razões de saúde e segurança, deve ser usada proteção ocular durante a infiltração.
   8. Limpe a suspensão bacteriana restante nas folhas e marque o limite da região infiltrada.
   9. Mantenha as plantas infiltradas nas mesmas condições de crescimento usadas para a etapa 1.1.1 por 2 dias.

4. Inoculação de Pseudomonas (4 dias)

1. Retire a estirpe de Pseudomonas transformada do estoque de glicerol no passo 2.5 em meio de ágar King's B com os antibióticos apropriados a 28 °C durante 2 dias.
   NOTA: A saúde de Pseudomonas é muito crítica. Se as colônias não se formarem bem, risque as células novamente ou propague as células no meio líquido do rei antes de prosseguir.
2. Inocular uma alça cheia de células de Pseudomonas em meio líquido de Manitol-Glutamato (MG) a 28 °C com agitação a 200 rpm durante a noite.
3. Colha as células por centrifugação a 3.000 x g por 10 min. Despeje o meio sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mM MgCl₂ e ajuste o OD₆₀₀ para 0,02 (1 x 10⁷ ufc / mL) para folhas de N. benthamiana e para 0,002 (1 x 10⁶ ufc / mL) para folhas de Arabidopsis.
4. Para o N. benthamiana, infiltre a suspensão de Pseudomonas na área das folhas onde a construção Agrobacterium portadora de sfGFP1-10^OPT foi infiltrada 2 dias antes (como na etapa 3.1.7). Para o sfGFP1-10^OPT transgênico Arabidopsis, infiltre a suspensão de Pseudomonas em duas folhas de 4 semanas de idade.
   NOTA: Pelo menos três plantas são necessárias para réplicas experimentais.

5. Observação do sinal sfGFP via microscopia confocal (1 dia)

1. Corte o disco foliar das folhas inoculadas com Pseudomonas. Em pontos de tempo específicos após a infiltração de Pseudomonas, crie imagens de dois discos de 2 folhas de² cm da planta única usando um sistema confocal de varredura a laser com objetiva de imersão em água C-Apochromat de abertura numérica (NA) de 40X/1,2 ou objetiva de imersão em óleo C-Apochromat de 63X/0,8 NA. Para evitar células mortas por ferimentos, observe as células longe do orifício de infiltração.
2. Inicie a observação com uma configuração de baixa potência do laser de argônio de 488 nm. Aumente a potência do laser para detectar sfGFP.
   NOTA: Geralmente usamos 2 a 15% da intensidade do laser para detectar o sinal de fluorescência. No entanto, a potência do laser e as configurações de detecção devem ser ajustadas com base no sistema de microscopia do usuário. Aqui, os filtros de emissão foram ajustados para 520 - 550 nm. As células mortas geralmente emitem autofluorescência sob a excitação do laser de 488 nm. Portanto, como controle negativo, o mesmo efetor sem a marca sfGFP11 deve ser infiltrado e observado nas mesmas condições de observação. Além disso, a alta excitação do laser pode induzir a autofluorescência da clorofila. Portanto, ajuste a intensidade do laser usando as células vegetais de controle para não induzir a autofluorescência da clorofila.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linhagens transgênicas de Arabidopsis			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitoramento espaço-temporal de efetores de Pseudomonas syringae via secreção tipo III usando fragmentos de proteína fluorescente dividida. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CITO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
VAI-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
Plasmídeo sfGFP1-10OPT direcionado a organelas			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitoramento espaço-temporal de efetores de Pseudomonas syringae via secreção tipo III usando fragmentos de proteína fluorescente dividida. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CITO-sfGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
PT-sfGFP1-10	Addgene	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene	97391
ER-sfGFP1-10	Addgene	97392
VAI-sfGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfCereja1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
CITO-sfCFP1-10	Addgene	97405
Vetor compatível com gateway marcado com sfGFP11 para sistema de entrega de efetor baseado em T3SS	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitoramento espaço-temporal de efetores de Pseudomonas syringae via secreção tipo III usando fragmentos de proteína fluorescente dividida. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à canamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à canamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à canamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à canamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à gentamicina (25 ug/ml)
Cepas bacterianas
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz e Jeff Schell, O promotor do gene TL-DNA 5 controla a expressão específica do tecido de genes quiméricos transportados por um novo tipo de vetor binário de Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistente à gentamicina (50 ug/ml) e rifampicina (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomate CUCPB5500			Kvitko, B. H. et al. Deleções no repertório de Pseudomonas syringae pv. Os genes efetores de secreção tipo III DC3000 do tomate revelam sobreposição funcional entre os efetores. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistente à rifampicina (100 ug/ml)
Componentes de mídia
Meios de germinação de plantas			Adicione 2.165g/L de pó de Murashige & Skoog, 10 g/L de sacarose à água. Ajustar para pH 5,8 e adicionar 2,2 g/L de fitagel. Autobezerro.
Murashige & Skoog meio incluindo vitaminas	Duchefa Biochemie	M0222	Conservar a 4 °C.
Sacarose	Duchefa Biochemie	S0809
Fitagel	Sigma-Aldrich	Pág. 8169
LB mídia			Adicione 10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura e 10 g/L de NaCl à água. Para meios sólidos, adicione 15 g/L de microágar. Autoclave. Deixe a solução arrefecer até 55 °C e adicione antibiótico, se necessário.
Triptona	BD Biociência	211705
Extrato de levedura	BD Biociência	212750
NaCl	Duchefa Biochemie	S0520
Micro ágar	Duchefa Biochemie	M1002
Mídia B do Rei			10 g/L de peptona de protease #2, 1,5 g/L de K2anidro HPO4, 15 g/L de ágar para água. Autoclave. Arrefecer até 55 °C e adicionar 15 ml/L de glicerol estéril e 5 ml/L de MgSO4 ao meio. Adicione antibióticos, se necessário.
Peptona de proteose	BD Biociência	212120
Anidro K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Glicerol	Duchefa Biochemie	G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Ágar Bacto	BD Biociência	214010
Meio líquido de manitol-glutamato (MG)			Adicione 10 g/L de manitol, 2 g/L de ácido L-glutâmico, 0,5 g/L de KH2PO4, 0,2 g/L de NaCl e 0,2 g/L de MgSO4 à água. Ajuste para pH 7
Manitol	Duchefa Biochemie	M0803
Ácido L-glutâmico	Duchefa Biochemie	G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
Tampão de infiltração			10 mM MES (ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico), 10 mM MgCl2, 150 μM acetosiringona. pH 5,6; Prepare um novo tampão antes de usar.
Economia de mercado	Duchefa Biochemie	M1503	Prepare 100 mM (pH 5,6) em água. Esterilize por filtro.
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Prepare 100 mM de estoque em água. Autoclave.
Acetosiringona	Sigma-Aldrich	D134406	Prepare o estoque de 150 mM em DMSO.
Equipamentos/materiais para microscópio confocal
Sistema confocal de varredura a laser 710	Carl Zeiss
Microscópio invertido Axio observer Z1	Carl Zeiss