Isolamento de colônias bacterianas direcionadas usando degradação de hidrogel com padrão de luz

Abstract

Fonte: Fattahi, N., et al. Interfaces de hidrogel fotodegradável para triagem, seleção e isolamento de bactérias. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra a extração de colônias bacterianas de um hidrogel fotodegradável usando luz UV. Uma colônia específica é selecionada e uma exposição à luz padronizada é projetada para iniciar a degradação localizada do hidrogel. Após ajustar a intensidade e a duração da luz, a luz UV é aplicada, liberando a colônia. A colônia é então aspirada através de tubos e transferida para um tubo para análise a jusante.

Protocol

1. Cepas bacterianas e protocolos de cultura

1. Colônias de bactérias em placas de ágar suplementadas com meios de crescimento apropriados. Neste relatório, B. subtilis (cepa 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) é cultivada em ATGN (0,079 M KH₂PO₄ (di-hidrogenofosfato de potássio), 0,015 M (NH₄)₂SO₄ (sulfato de amônio), 0,6 mM MgSO₄·7H₂O (sulfato de magnésio heptahidratado), 0,06 mM CaCl₂·2H₂O (cloreto de cálcio di-hidratado), 0,0071 mM MnSO₄·H₂O (sulfato de manganês(II) monohidratado), 0,125 M FeSO₄ · 7H₂O (sulfato ferroso heptahidratado), 28 mM de glicose, pH: 7 ± 0,2, 15 g / L de ágar) placas de ágar suplementadas com 100 μg / mL de espectinomicina e E. coli (cepa 25922, ATCC) em placas de ágar ATGN suplementadas com 100 μg / mL de ampicilina.
   NOTA: Relatórios anteriores de encapsulamento e liberação de hidrogel com esses materiais usaram células C58 de A. tumefaciens
2. Escolha as colônias desejadas das placas de ágar ATGN e inicie as culturas durante a noite. Para as estirpes de E. coli e B. subtilis aqui utilizadas, cultivar a 37 °C agitando a 215 rpm em meio líquido ATGN durante 24 h. Armazene as culturas de células em glicerol a 50% a -80 °C até uso futuro.
3. Colher colónias de ambas as estirpes das reservas de glicerol utilizando alças de inoculação estéreis e incubar em meio líquido ATGN durante 24 h a 37 °C e 215 rpm.

2. Preparação do material necessário para a formação do hidrogel

1. Síntese fotodegradável de PEG-o-NB-diacrilato (Poli(etilenoglicol)-orto-nitrobenzil-diacrilato)
   NOTA: A síntese interna do diacrilato PEG-o-NB foi bem descrita e relatada anteriormente. Alternativamente, como a síntese é rotineira, ela pode ser terceirizada de uma instalação de síntese química.
2. Buffer de reticulação
   1. Pegue a receita do meio selecionado para a cepa bacteriana e prepare o meio com 2x nutrientes. Adicione fosfato, por exemplo, NaH₂PO₄ (di-hidrogenofosfato de sódio), ao meio até uma concentração final de 100 mM. Em seguida, ajuste o valor do pH para 8 usando 5 M NaOH (hidróxido de sódio) (aquoso).
   2. Esterilizar a solução tampão e conservá-la a -20 °C até nova utilização.
      NOTA: Deixe de fora quaisquer metais de transição presentes no meio, pois esses metais catalisam a oxidação dos tióis em dissulfetos.
3. Solução de diacrilato de PEG-o-NB
   1. Para cada mg da alíquota de pó de diacrilato de PEG-o-NB (peso molecular de 3.400 Da), adicione 3,08 μL de água ultrapura para atingir a concentração de 49 mM de diacrilato de PEG-o-NB (concentração de acrilato de 98 mM).
   2. Vortex a solução até que esteja bem misturada e armazene esta solução a -20 °C até nova utilização.
4. Solução de PEG-tiol de 4 braços
   1. Para a preparação de PEG-tiol (peso molecular de 10.000 Da) de 4 braços, adicione 4 μL de água ultrapura por mg de pó para atingir uma concentração de 20 mM (80 mM de concentração de tiol).
   2. Vortex esta solução até que esteja bem misturada e armazene-a a -20 °C até nova utilização.

3. Preparação de lamínulas perfluoroalquiladas (não reactivas)

1. Coloque até 5 lâminas de vidro (25 mm x 75 mm x 1 mm) dentro de uma mala direta de polipropileno. Sonicar as lâminas com uma solução detergente a 2% (p/v) (Tabela de Materiais) durante 20 min.
2. Enxágue as lâminas três vezes com água ultrapura e, em seguida, sonice as lâminas em água por 20 min. Secar as lâminas com uma corrente de N₂ (azoto).
3. Plasma limpo (ver Tabela de Materiais) em ambos os lados das lâminas de vidro de acordo com o protocolo na seção 4.1 por 2 min.
4. Coloque as lâminas limpas com plasma de volta na mala direta e encha o recipiente com uma solução a 0,5% (v / v) de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H, -perfluorooctil) silano em tolueno. Deixe essas lâminas de vidro serem funcionalizadas por 3 h em temperatura ambiente (RT).
5. Depois que as lâminas estiverem funcionalizadas, enxágue as lâminas dentro do envelope de lâminas, primeiro com tolueno e depois com etanol (três vezes com cada solvente). Em seguida, seque cada lâmina funcionalizada com um jato de N₂.

4. Preparação de lamínulas funcionalizadas com tiol (base)

1. Limpeza das lamínulas de vidro com um limpador de plasma
   1. Coloque lamínulas de 18 mm x 18 mm em uma placa de Petri. Em seguida, coloque a placa de Petri em uma câmara de limpeza de plasma e ligue a energia do limpador de plasma.
   2. Ligue a bomba de vácuo para limpar o ar dentro da câmara até que o manômetro indique 400 mTorr.
   3. Abra a válvula dosadora para deixar o ar entrar na câmara até que o manômetro atinja uma pressão constante (800-1000 mTorr). Em seguida, selecione RF com o modo "Hi" e exponha as lamínulas por 3 minutos.
   4. Após 3 minutos, desligue o modo RF e a bomba de vácuo.
   5. Retire a placa de Petri da câmara, vire as lamínulas, coloque-as de volta na câmara para o plasma e exponha o outro lado da lamínula de vidro.
   6. Repita as etapas 4.1.2 a 4.1.4 para limpar o lado não tratado da lamínula de vidro com plasma.
   7. Depois de concluir o processo, remova a placa de Petri da câmara e desligue o limpador de plasma e a bomba de vácuo.
2. Limpeza e hidroxilação das lamínulas com solução de piranha
   NOTA: Os protocolos padrão de limpeza de piranhas podem ser usados para limpar e hidroxilar tiras de vidro. A solução de piranha é uma mistura 30:70 (v/v) de H₂O₂ (peróxido de hidrogênio) e H₂SO₄ (ácido sulfúrico). Métodos alternativos de limpeza de lamínulas de vidro também podem ser usados.
   CUIDADO: A solução de piranha é fortemente corrosiva e explosiva com solventes orgânicos e deve ser manuseada com extremo cuidado. Medidas apropriadas de segurança e contenção devem ser implementadas, como o uso de equipamentos de proteção individual adequados (jaleco, avental resistente a produtos químicos, óculos de segurança, protetor facial, luvas de butilo resistentes a ácidos). Todos os copos e superfícies de trabalho em contato com a solução de piranha devem estar limpos, secos e livres de resíduos orgânicos antes do uso. A solução de piranha nunca deve ser armazenada em um recipiente parcialmente fechado ou fechado.
   1. Coloque um prato de vidro limpo de 100 mm x 50 mm em um agitador magnético de placa de aquecimento com velocidade de agitação ajustável sob uma capela de exaustão e adicione 14 mL de H₂SO₄ ao prato.
   2. Coloque delicadamente uma pequena barra de agitação magnética revestida de Teflon usando uma pinça revestida de teflon dentro do prato. Em seguida, gire o agitador lentamente para evitar respingos de ácido.
   3. Em seguida, adicione suavemente 6 mL de H₂O₂ ao prato e deixe a solução ficar bem misturada.
   4. Desligue o agitador e, em seguida, remova a barra de agitação do prato usando a pinça. Em seguida, coloque delicadamente as lamínulas dentro do prato usando a pinça e ajuste a temperatura para 60–80 °C.
   5. Após 30 min, remova suavemente as lamínulas usando a pinça e mergulhe-as em água deionizada (DI) duas vezes para lavar a solução residual de piranha.
   6. Após enxaguar com água, guarde as lamínulas em água DI em RT até uso posterior.
   7. Desligue a placa de aquecimento e deixe a solução de piranha esfriar.
   8. Para descartar a solução de piranha, coloque cuidadosamente o prato de vidro de 100 mm x 50 mm contendo a solução de piranha resfriada em um copo de vidro maior e vazio com pelo menos 1.5 L de volume. Em seguida, adicione 1 L de água para diluir e adicione bicarbonato de sódio em pó para neutralizar. Observe que o bicarbonato de sódio causará borbulhamento e geração de calor e deve ser adicionado muito lentamente; caso contrário, o borbulhar pode levar a respingos de ácido. Quando a adição adicional de bicarbonato de sódio não causar borbulhamento, verifique o pH com papel de pH para verificar se ele foi neutralizado. Uma vez que a solução é neutralizada e resfriada, ela pode ser despejada na pia.
3. Funcionalização tiol das lamínulas
   1. Preparar uma solução a 5% (v/v) de 269 mM de solução de (3-mercaptopropil) trimetoxissilano (MPTS) em tolueno seco.
   2. Adicione 10 mL da solução a tubos de centrífuga cônicos individuais de 50 mL. Coloque uma lamínula limpa em cada tubo e mergulhe-a na solução.
      NOTA: Uma lamínula por tubo de 50 mL é usada para garantir a tiolação de ambos os lados do substrato sem ser perturbada por outros substratos.
   3. Após 4 h, lave cada lamínula (quatro lavagens por lamínula) com tolueno, uma mistura de etanol: tolueno 1:1 (v/v) e etanol.
      NOTA: Isso é feito imergindo cada lamínula sequencialmente em tubos de centrífuga cônicos contendo as soluções mencionadas.
   4. Depois de enxaguar o substrato, mergulhe-o em etanol e conserve-o a 4 °C até nova utilização.
      NOTA: Dependendo do número de lamínulas, este método pode se tornar trabalhoso devido ao tratamento de lamínulas uma de cada vez. Para várias lamínulas, podem ser usados potes Columbia que cabem em várias lamínulas ao mesmo tempo.

5. Fabricação de matrizes de micropoços de silício

1. Revestimento de parileno: Use o protocolo padrão descrito em artigos de pesquisa anteriores para revestir wafers de silício com parileno.
2. Microfabricação: Siga o protocolo descrito por Barua et al. para projetar e fabricar a matriz de micropoços. ​

6. Formação de hidrogel

1. Formação de hidrogel a granel em lamínulas de vidro
   1. Solução precursora de hidrogel: Adicione 12,5 μL do tampão de reticulação a um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, seguido por 5,6 μL de solução de diacrilato de PEG-o-NB. Por fim, adicione 6,9 μL de solução de PEG-tiol de 4 braços à mistura.
      NOTA: Adicionar o tiol PEG de 4 braços à mistura inicia a reação de reticulação. Assim, a solução precursora de hidrogel deve ser usada imediatamente após a mistura.
   2. Para encapsulamento celular na solução precursora de hidrogel, siga as etapas 6.1.3-6.1.9.
   3. Para encapsulamento celular, antes da etapa 6.1.1, inocule o tampão de reticulação com a densidade celular desejada. Conforme relatado anteriormente19, observou-se que a densidade celular de 7,26 × 10⁷ UFC/mL no tampão de reticulação se correlaciona com uma densidade de ~ 90 células/^mm2 encapsulado através do hidrogel.
   4. Coloque a lamínula de base tiolada em uma placa de Petri limpa. Coloque dois espaçadores (consulte Tabela de Materiais) nos dois lados opostos da lamínula.
      NOTA: A funcionalização do tiol das lamínulas é necessária para a fixação covalente do hidrogel à superfície da lamínula. Isso é feito através da reação de grupos tióis na superfície e os grupos acrilato presentes na solução precursora de hidrogel.
   5. Fixe os espaçadores na lamínula da base colando os espaçadores na placa de Petri.
   6. Pipetar o volume desejado da solução precursora numa lâmina de vidro perfluoroalquilada não reactiva.
   7. Coloque a lâmina de vidro perfluoroalquilada na lamínula da base (Figura 1C). Aguarde 25 minutos em RT para que a formação do hidrogel seja concluída.
   8. Após a gelificação, remova suavemente a lâmina de vidro perfluoroalquilada. O hidrogel ficará preso à lamínula da base. ​
      NOTA: Para lamínulas de 18 mm x 8 mm para obter uma membrana de 12,7 μm de espessura, use ~ 7 μL da solução precursora ( Figura 1A , B ). O uso de volumes maiores de solução precursora pode resultar em um hidrogel sob a lamínula de base. Isso pode fazer com que a lamínula da base grude na placa de Petri e quebre após uma tentativa de remoção. Além disso, o resíduo de hidrogel sob a lamínula é problemático para a microscopia. É necessária a remoção suave da lâmina de vidro perfluoroalquilada não reativa, pois a remoção rápida pode danificar o hidrogel.
   9. Colocar o substrato numa placa de Petri de 60 mm x 15 mm nos meios de cultura especificados. Aqui, o meio ATGN suplementado com 100 μg / mL de espectinomicina para B. subtilis ou 100 μg / mL de ampicilina para E.coli a 37 ° C foi usado por 24 h de cultivo.

7. Preparação de material para extração celular

1. Preparação do suporte PDMS (Polidimetilsiloxano)
   1. Cole uma pilha de dez lamínulas de 18 x 18 mm e cole essa pilha de lamínulas no fundo de uma placa de Petri.
   2. Para fabricar suportes PDMS, misture o precursor PDMS e o agente de cura em uma proporção de volume de 10:1 em um copo plástico, desgaseifique a mistura em um dessecador a vácuo e, em seguida, despeje a mistura na placa de Petri.
   3. Catalise o PDMS durante 90 min a 80 °C. Em seguida, corte ao redor do bloco colado para remover o suporte do PDMS e coloque o suporte do PDMS em uma lâmina de vidro para facilitar o manuseio da microscopia.
2. Preparação de microsseringas e tubos
   1. Corte 20 cm de tubo de PTFE (politetrafluoretileno) (0,05 pol. de diâmetro interno) e conecte uma extremidade do tubo a uma seringa de microlitro de 100 μL.
      NOTA: Para extração, evite usar pipetas, pois aspirar as células liberadas por meio de uma ponta de pipeta pode danificar a superfície do hidrogel e causar contaminação.

8. Degradação do hidrogel com a ferramenta de iluminação padronizada

1. Ligue o microscópio (consulte a Tabela de Materiais). Em seguida, ative a ferramenta de iluminação padronizada (consulte Tabela de materiais).
2. Ligue o módulo de controle analógico e digital da fonte de luz LED de 365 nm. Em seguida, ligue o módulo de controle da fonte de luz LED.
3. Abra o software do microscópio e o software da ferramenta de iluminação padronizada. Quando a janela de configuração de hardware for aberta, selecione o botão Carregar.
   NOTA: Três dispositivos serão carregados aqui. (Câmera de terceiros, um módulo de controle e a ferramenta de iluminação padronizada)
4. Pressione o botão Iniciar. A janela do software de padronização de luz será aberta agora. Selecione a primeira opção, o botão Controle de dispositivos, na barra lateral esquerda da janela.
5. Calibre a ferramenta de iluminação padronizada.
   NOTA: A calibração deve ser feita com a mesma objetiva e filtro do microscópio que será usado para exposição à luz.
   1. Defina a objetiva do microscópio para ampliação de 10x.
      NOTA: Esta ampliação permite distância de trabalho suficiente entre a lente do microscópio e a superfície da amostra. Também permite monitorar e registrar o processo de recuperação em tempo real através da janela de imagem.
   2. Defina a lente e o filtro do microscópio para as configurações usadas para exposição à luz e coloque o espelho de calibração sob o microscópio.
   3. Na janela Controle de dispositivos, pressione a guia Controle de LED. Ligue o LED #1 e defina a intensidade da luz para o número desejado. Em experimentos de extração padrão, isso é definido como 60%.
   4. Pressione a guia intitulada com o nome do produto da ferramenta de iluminação padronizada na janela Controle de dispositivos. Em seguida, pressione o botão Mostrar grade.
      NOTA: Um padrão de grade será projetado no espelho de calibração.
   5. Ajuste o foco do microscópio e a exposição da câmera para obter alta qualidade de imagem da grade e gire a câmera para alinhar as linhas de grade paralelas à moldura da janela da câmera, se necessário.
   6. Selecione o botão Assistente de calibração na guia intitulada com o nome do produto da ferramenta de iluminação padronizada e siga as instruções fornecidas pelo software nesta janela. NOTA: Uma janela de configuração de câmera de terceiros será aberta.
   7. Uma janela de seleção de tipo de calibração será aberta. Selecione Calibração automática e pressione Avançar.
   8. Quando a janela Ajuste de pré-calibração for aberta, siga as instruções do software e pressione o botão Avançar.
   9. Quando a janela Informações de mapeamento for aberta, salve essa calibração de acordo com a pasta desejada. Isso é feito colocando a data, o nome do microscópio, a lente objetiva e o filtro.
   10. Após a calibração, pressione o botão Definição da área de trabalho localizado na guia intitulada com o nome do produto da ferramenta de iluminação padronizada para definir a área de trabalho da ferramenta de iluminação padronizada, se necessário.
6. Seção de design de sequência para preparação de padrões.
   1. Pressione o botão Sequence Design na barra lateral esquerda da janela do software. Em seguida, pressione o botão Editor de sequência de perfil.
   2. Quando a janela Editor de sequência de perfil for aberta, selecione a opção Novo perfil na Lista de perfis.
      NOTA: Agora, uma janela do Editor de padrões será aberta.
   3. Prepare o padrão desejado para exposição à luz escolhendo diferentes formas e tamanhos de padrão ou desenhando manualmente o padrão, se desejar.
   4. Para padrões circulares e cruzados quebrados para o hidrogel a granel, siga as etapas 8.6.5 a 8.6.6
   5. Para padrões circulares, defina um círculo com um diâmetro de 30 μm sobre uma colônia bacteriana alvo para cobrir toda a colônia. Escolha a cor de preenchimento da forma branca.
   6. Para padrões cruzados quebrados, escolha a forma retangular na janela de desenho do padrão com dimensões de 3 μm x 8 μm. Coloque quatro retângulos com essas dimensões nas bordas da colônia alvo, enquanto metade dos padrões tem uma sobreposição com a colônia.
   7. Para padrões de círculo e anel para as matrizes de micropoços, siga as etapas 8.6.8-8.6.10.
   8. Para padrões circulares, desenhe um círculo de 10 μm de diâmetro ao redor do perímetro do poço. Escolha a cor de preenchimento da forma branca.
   9. Para o padrão de anel, desenhe um círculo de diâmetro 20 μm, coloque-o sobre o poço e escolha a cor de preenchimento da forma branca.
   10. Desenhe outro padrão de círculo de diâmetro de 10 μm com a cor preta da forma de preenchimento e coloque-o ao redor do perímetro do poço.
7. Edite o padrão e modifique as formas com base no método de extração desejado. Certifique-se de que o padrão desejado exista dentro da área de trabalho da ferramenta de iluminação padronizada.
8. Coloque a amostra em um suporte PDMS e pipete o meio definido em cima da amostra para evitar a desidratação da amostra e fornecer uma solução transportadora para as células liberadas.
9. Em seguida, substitua-o pelo espelho de calibração.
10. Ajuste o foco do microscópio para obter uma imagem nítida das colônias dentro do hidrogel. Inspecione as colônias para identificar uma colônia de interesse.
11. Aqui, projete os padrões de luz enquanto a visão da câmera mostra as colônias dentro da amostra para testar diferentes padrões de extração de células.
12. Salve o padrão definido. Depois de salvar o padrão definido, selecione a seção Controle de sessão.
13. Nesta seção, na guia intitulada com o nome do produto da ferramenta de iluminação padronizada, adicione a sequência salva.
14. Depois de adicionar a sequência, escolha a opção de simular o padrão para visualizar e ajustar para o local de exposição desejado.
    NOTA: A localização da amostra pode ser ajustada aqui para garantir que o padrão seja projetado com precisão na área de destino.
15. Em seguida, ajuste a intensidade da luz para 60% e o tempo de exposição para 40 s na guia de controle do LED e inicie o processo de exposição.
16. Monitore a degradação do hidrogel em tempo real e no modo de campo claro para garantir a liberação da célula.
    NOTA: Evite qualquer movimento na amostra durante a exposição à luz, pois isso pode causar degradação de áreas indesejadas do hidrogel, resultando em contaminação cruzada.

9. Recuperação de células

1. Após exposição à luz de 365 nm e liberação celular, as células são coletadas usando uma seringa de microlitro e tubo microfluídico (Figura 2).
   NOTA: A recuperação celular precisa ser feita imediatamente após a exposição do padrão. Isso permite a recuperação celular localizada antes que as células liberadas se afastem da área irradiada.
2. Mude o microscópio de campo claro para filtro FITC ou TRITC para permitir a visualização da área exposta da amostra a olho nu.
3. Uma vez localizada a área exposta, coloque a extremidade da tubulação sobre o ponto irradiado. Em seguida, mude o filtro do microscópio de volta para campo claro para monitorar a recuperação da célula em tempo real.
4. Use a seringa presa à outra extremidade do tubo para retirar cuidadosamente as células liberadas. Retire 200 μL da solução e insira a solução em um tubo de centrífuga de 1,5 mL para análise de DNA ou plaqueamento.

Results

Figura 1: Formação de hidrogel em lamínulas de vidro tiolado. (A) Espaçadores com espessura de 12,7 μm são colocados em dois lados opostos de uma lamínula de base contendo grupos tióis reativos. (B) A solução precursora de hidrogel é pipetad...

Materials