Quantificação de alginato bacteriano usando o ensaio de carbazol de ácido urônico

Resumo

Fonte: Al Ahmar, R., et al. Cultura de Variante de Pequena Colônia de Pseudomonas aeruginosa e Quantificação de seu Alginato. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra um ensaio colorimétrico para quantificar o alginato produzido por Pseudomonas aeruginosa, usando carbazol para detectar ácidos urônicos após hidrólise ácida. O método permite a análise comparativa da produção de alginato normalizada à biomassa bacteriana em pesquisas e estudos clínicos.

Protocolo

1. Ensaio de carbazol de ácido urônico

1. Identificar uma única colónia de uma cultura pura da estirpe pretendida a ensaiar. Usando um palito estéril, pegue a colônia e coloque-o em um tubo de ensaio de cultura contendo 5 mL de caldo de isolamento de Pseudomonas (PIB). Crescer numa incubadora shaker a 37 °C durante 24 h.
   NOTA: As seguintes cepas, PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB e PAO581pyrD, foram cultivadas em placas PIA (Pseudomonas isolation agar) ou placas PIA suplementadas com uracila 0,1 mM para colher alginato para medição.
2. Em uma placa PIA pré-aquecida, adicione 150 μL de caldo PIB cultivado (para placas de 15 mm x 100 mm) ou 450 μL de caldo (para placas de 15 mm x 150 mm). Usando um espalhador de células estéreis, espalhe o caldo sobre o prato. Aumente a placa a 37 °C por 24 h.
   NOTA: Aspire qualquer excesso de líquido, se houver, da placa usando uma pipeta, inclinando a placa para um lado. As placas de PIB e PIA usadas no protocolo contêm 20 mL / L de glicerol, que as células usam como fonte de carbono para auxiliar na produção de alginato.
3. Usando um controlador de pipeta e uma pipeta estéril de 50 mL, adicione NaCl (cloreto de sódio) a 0,85% ao gramado cultivado e colete a amostra raspando a placa usando um espalhador de células. Aspire a amostra usando uma pipeta nova de 50 mL para um tubo de coleta de 50 mL. Vortex a amostra em alta para misturar e colocar as amostras no gelo.
   NOTA: O volume de NaCl a 0,85% adicionado varia de acordo com o tamanho da placa. Para placas de 15 mm x 100 mm, use 10−30 mL e, para placas de 15 mm x 150 mm, use 20−50 mL.
4. Meça a densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) das amostras adicionando 1 mL da amostra a uma cubeta descartável e lendo a DO usando um espectrofotômetro. Repita esta etapa 2x para obter um triplicado de leituras para cada amostra.
5. Adicione 3 mL da solução de ácido sulfúrico / borato aos tubos de cultura e deixe descansar no gelo. Adicionar lentamente 350 μL da amostra recolhida à mistura de ácidos nos tubos de ensaio e vórtice em baixa intensidade.
   1. Prepare o caldo de borato adicionando 10,099 g de pó de hidróxido de potássio (KOH) a 45 mL de água. Adicione 24,74 g de ácido bórico (H₃BO₃) à mistura e leve o volume para 100 mL.
   2. Coloque uma garrafa de 1 L em uma pia com gelo e encha-a com 500 mL de ácido sulfúrico concentrado. Adicione LENTAMENTE 15 mL do estoque de borato preparado. Deixe a garrafa esfriar.
   3. Adicione mais 10 mL de caldo de borato para um total de 25 mL. Assim que a garrafa esfriar, aumente o volume para 1 L.
      CUIDADO: Este método depende do uso de ácido sulfúrico altamente concentrado. Equipamento de proteção individual adequado deve ser usado para garantir a segurança, e o protocolo de descarte adequado para a amostra deve ser seguido.
      NOTA: Para um controlo positivo, é colhida e purificada uma concentração conhecida de ácido D-manurónico e/ou uma amostra de alginato bacteriano conhecida através de estirpes produtoras de alginato de P. aeruginosa (por exemplo, PAO581-PAO1mucA25). Para um controle negativo, use uma solução de NaCl a 0,85% e/ouPAO1Δ algD (deleção no quadro do gene algD que torna a bactéria completamente incapaz de produzir alginato). Vários tubos podem ser feitos de cada amostra para aumentar o número de repetições técnicas para auxiliar na análise estatística. Prepare 3−5 tubos de cada amostra.
6. Adicione 100 μL de carbazol a 0,1% em solução de etanol à mistura ácido/amostra. Tampe o tubo e o vórtice em configuração média por 5 s. Colocar em banho seco a 55 °C durante 30 min.
7. Após a incubação, remova os tubos e o vórtice brevemente em alta e deixe esfriar por 5 min.
   NOTA: A cor a ser vista seria um tom de roxo. A cor permanecerá estável para medição por 1−2 h.
8. Leia o OD₅₃₀ de cada tubo adicionando 1 mL da mistura a uma cubeta limpa e lendo o OD das amostras a 530 nm em um espectrofotômetro. Use o tubo com NaCl a 0,85% como um espaço em branco no espectrofotômetro.
9. Preparar uma curva padrão medindo a DO₅₃₀ de diluições seriadas de concentrações conhecidas de ácido D-manurónico (1.024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml e 8 μg/ml). Repita 2x. Extraia uma equação linear dessas leituras.
   NOTA: A curva padrão só precisa ser feita uma vez. A equação linear extraída dele pode ser usada para testes posteriores.
   1. Calcular a concentração de alginato em cada amostra utilizando a curva-padrão e dividir a concentração de alginato da equação linear por OD₆₀₀ para obter a quantidade total de alginato por OD₆₀₀.

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