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1. ELISA para quantificação de alginato
1. Usando uma micropipeta, adicione 50 μL da amostra coletada a uma placa de 96 poços não tratada. Adicione 50 μL de tampão de revestimento (tampão carbonato/bicarbonato pH 9,6) aos poços. Incubar a placa a 37 °C durante 2 h.
NOTA: Para um controlo positivo, pode utilizar-se uma concentração conhecida de ácido D-manurónico e/ou uma estirpe produtora de alginato estável conhecida (por exemplo, PAO581- PAO1mucA25). Para um controle negativo, use uma solução de NaCl a 0,85% e / ou PAO1ΔalgD (a deleção do gene algD torna a bactéria completamente incapaz de produzir qualquer alginato). Vários poços podem ser feitos a partir de cada amostra para aumentar o número de repetições técnicas para auxiliar na análise estatística. Prepare 3−5 poços de cada amostra.
2. Usando uma garrafa de esguicho, lave os poços da placa 2x com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 0,05% Tween 20 (PBS-T) enchendo os poços e, em seguida, drenando-os virando a placa.
3. Usando uma micropipeta, adicione 200 μL de tampão de bloqueio (10% de leite desnatado em PBS-T) aos poços. Incubar a 4 °C durante a noite.
NOTA: Embrulhe o prato em filme de parafina ou filme retrátil para ajudar a evitar qualquer evaporação na geladeira.
4. Usando uma garrafa de esguicho, lave os poços da placa 2x com PBS-T enchendo os poços e, em seguida, drenando-os virando a placa.
5. Usando uma micropipeta, adicione 100 μL de anticorpo primário diluído (anticorpo monoclonal anti-alginato de camundongo) aos poços e incube a 37 ° C por 1-2 h.
NOTA: O anticorpo primário (anticorpo monoclonal antialginato de camundongo) foi fornecido na concentração de 0,5 μg/mL (diluição de 1:2.000 de estoque de 1 mg/mL) em solução diluente de anticorpos (leite desnatado a 1% em PBS 1x).
6. Usando uma garrafa de esguicho, lave os poços da placa 3x com PBS-T enchendo os poços e, em seguida, drenando-os virando a placa.
7. Usando uma micropipeta, adicione 100 μL de anticorpo secundário diluído aos poços e incube a 37 ° C por 1-2 h.
NOTA: O anticorpo secundário utilizado foi o anticorpo peroxidase de poli-rábano (HRP) de cabra perfurada a uma concentração de 0,25 μg/mL (diluição de 1:2.000 de 0,5 mg/mL de estoque) em solução diluente de anticorpos.
8. Usando uma garrafa de esguicho, lave os poços da placa 3x com PBS-T enchendo os poços e, em seguida, drenando-os virando a placa.
9. Usando uma micropipeta, adicione 100 μL de solução TMB (3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina)-ELISA (Ensaio de Imunoabsorção Enzimática) (Tabela de Materiais) e incube em temperatura ambiente por 30 min no escuro.
NOTA: A cor de uma reação positiva seria um tom de azul.
10. Usando uma micropipeta, adicione 100 μL de solução de parada (ácido sulfúrico 2 N).
NOTA: A cor mudará de azul para amarelo quando a solução de parada for adicionada. A cor é estável por até 30 minutos após a interrupção da reação.
11. Usando um leitor de placas, leia o diâmetro externo a 450 nm.
12. Produza uma curva padrão medindo o OD450 de diluições seriadas de concentrações conhecidas de ácido D-manurônico (1.024 μg / mL, 512 μg / mL, 256 μg / mL, 128 μg / mL, 64 μg / mL, 32 μg / mL, 16 μg / mL e 8 μg / mL). Repita 2x. A partir dessas leituras, extraia uma equação linear.
NOTA: A curva padrão precisa ser feita apenas uma vez. A equação linear extraída dele pode ser usada para testes posteriores.
1. Calcular a concentração de alginato em cada amostra utilizando a curva padrão e dividir a concentração de alginato da equação linear por OD600 para obter a quantidade total de alginato por OD600.