Modelagem da colonização vaginal murina por bactérias anaeróbias

Resumo

Fonte: Morrill, S. R., et al. Modelos de colonização vaginal murina por bactérias cultivadas anaeróbicas. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra um protocolo para modelar a colonização vaginal em camundongos usando bactérias anaeróbicas resistentes a antibióticos. Começa com o tratamento hormonal para aumentar a suscetibilidade epitelial, seguido pela inoculação vaginal e co-inoculação em condições anaeróbicas. O procedimento termina com amostragem pós-inoculação e cultura para avaliar a colonização bacteriana e a formação de biofilme.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação do inóculo

NOTA: Esta secção contém os passos gerais para a preparação de inóculos a partir de Gardnerella vaginalis resistente à estreptomicina cultivada anaeróbia JCP8151B-SmR. Todas as etapas desta seção devem ser realizadas em uma câmara anaeróbica.

1. Cicle todos os reagentes, incluindo caldo preparado da cidade de Nova York III (NYCIII), ágar e solução salina tamponada com fosfato (PBS), em uma câmara anaeróbica para equilibrar por pelo menos 24 h antes do uso.
   NOTA: Aqui, foi utilizada uma câmara anaeróbia de vinil equilibrada com uma mistura gasosa de hidrogênio a 5%. A concentração interna de oxigênio normalmente fica em 0 ppm, embora possa haver aumentos transitórios de baixo nível (10-25 ppm) ao colocar materiais na câmara.
2. Dois dias antes da inoculação vaginal, retire Gardnerella de um estoque de glicerol congelado em uma placa de ágar NYC III na câmara anaeróbica. Use um pequeno recipiente (como uma caixa vazia de ponteira de pipeta) cheio de gelo seco para manter o estoque de glicerol congelado durante o transporte para dentro e para fora da câmara.
3. 1 dia antes da inoculação vaginal, use 5-10 colônias individuais de Gardnerella da placa para inocular 10 mL de caldo NYC III. Deixar a cultura líquida crescer durante 16 h a 37 °C. Incluir uma segunda alíquota de 1 ml do meio de cultura que não foi inoculado e incubá-la juntamente com a cultura inoculada para confirmar que o meio não está contaminado.
4. Preparar o inóculo a partir de cultura líquida como a seguir descrito. Efectuar a preparação do inóculo na câmara anaeróbia tanto quanto possível.
   1. Determinar a densidade óptica (DO) da cultura adicionando 200 μL de cultura a 800 μL de meio fresco em uma cubeta de 1,5 mL (diluição 1:5). Utilizar um espectrofotómetro para medir a densidade (DO) da cultura diluída no comprimento de onda de 600 nm (utilizar uma cubeta separada apenas com meios frescos como branco). Multiplique a leitura de OD por 5 para obter o OD₆₀₀ real da cultura de 16 h.
   2. Calcular o volume de inóculo necessário para a experiência. Por exemplo, para infectar 15 camundongos com um inóculo de 20 μL por camundongo, são necessários 15 x 20 μL = 300 μL de inóculo. Prepare aproximadamente 25% mais inóculo do que o necessário, portanto, para 15 camundongos, prepare 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL de inóculo.
   3. Utilizando a DO₆₀₀ determinada no passo 1.4.1, calcular o volume da cultura de 16 h que deve ser centrifugado e ressuspenso para obter um inóculo OD₆₀₀ = 5,0 no volume calculado no passo 1.4.2. Por exemplo, se o OD₆₀₀ da cultura for 1,5 e o volume de inóculo necessário for 375 μL, então o volume de cultura a ser girado é (375 μL x 5) / 1,5 = 1250 μL.
   4. Pipetar o volume de cultura calculado no passo 1.4.3. em um tubo de microcentrífuga estéril. Pulverize as bactérias centrifugando a 16.000 x g por 1-3 min.
   5. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em PBS anaeróbio ao volume calculado no passo 1.4.2. O inóculo agora estará em um OD_{calculado 600} de 5,0. Se aplicável, prepare também um tubo de PBS para servir como controle de veículo para camundongos no grupo de controle não infectado.
5. Antes de remover o tubo de inóculo da câmara anaeróbia, preparar uma série de diluições seriadas de 1:10 a 1:10 x^10,6 em PBS. Placa pontual 5 réplicas de cada diluição em uma placa de ágar usando uma pipeta multicanal para determinar as unidades formadoras de colônias ou UFC do inóculo. Esta é a UFC pré-inoculação.
6. Pré-lavagem vaginal e inoculação com Gardnerella
   1. Prepare tubos de lavagem/lavagem vaginal na câmara anaeróbica. Pipete 70 μL de PBS anaeróbico estéril em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL marcados com números de camundongos. Prepare um tubo de lavagem por mouse. Feche bem os tubos e retire-os da câmara anaeróbica.
   2. Efectuar uma lavagem vaginal em cada ratinho com 50 μL de PBS anaeróbio a partir dos tubos individuais preparados no passo 2.1. Essas lavagens vaginais são as lavagens pré-inoculação e podem ser usadas para medições e ensaios a jusante.
      1. Após a administração da segunda injeção de valerato de β-estradiol, coloque cada camundongo em cima de uma gaiola ou de uma superfície limpa e dura que possa segurar com as patas dianteiras. Segure suavemente a parte central da cauda e levante de modo que os quartos traseiros fiquem ligeiramente elevados e a abertura vaginal fique exposta.
      2. Usando uma pipeta e uma ponta de filtro p-200, retire 50 μL de PBS do tubo de lavagem correspondente ao mouse apropriado. Insira suavemente a ponta da pipeta no lúmen vaginal ~ 2-3 mm e pipete o volume de 50 μL para dentro e para fora suavemente, 3x-4x.
      3. Transfira o material de lavagem coletado (~ 50 μL) de volta para o mesmo tubo de lavagem de onde veio, pipetando para cima e para baixo no tubo de lavagem que ainda contém os 20 μL restantes de PBS. Se houver muco excessivo e a ponta ficar entupida, use uma ponta p200 limpa para coletar o material restante e coloque-o no mesmo tubo de lavagem.
   3. Administre por via vaginal 20 μL da suspensão bacteriana concentrada ou controle do veículo na vagina de cada camundongo. Inocule cada camundongo imediatamente após a lavagem vaginal para esse camundongo (ou seja, realize lavagem e inoculação em sequência para cada camundongo antes de passar para o próximo). Para simplificar esse processo, use duas pipetas p200 - uma ajustada para 50 μL para lavagens e a outra para 20 μL para inoculações.
      1. Restrinja o mouse conforme descrito na etapa 2.2.1. Usando uma ponta p-200, pipete 20 μL de suspensão bacteriana na vagina. Para experimentos de coinoculação usando duas espécies/cepas bacterianas diferentes, use 10 μL de cada suspensão bacteriana e evite misturar as duas cepas antes da inoculação.
         NOTA: O volume total de inoculação não deve exceder 20 μL para evitar derramamento para fora da vagina.
      2. Continue a segurar a extremidade traseira de cada camundongo por 10-20 s para evitar que o volume administrado se acumule imediatamente no intróito vaginal. Em seguida, coloque o camundongo em uma nova gaiola / receptáculo ou com companheiros de gaiola que já foram inoculados.
      3. Repita a etapa 2.2. e etapa 2.3. para cada mouse. Nunca coloque os ratos de volta em uma gaiola com animais que ainda não foram inoculados. Isso evita a exposição inadvertida de camundongos a bactérias resistentes à estreptomicina antes da inoculação.
   4. Depois que todos os camundongos tiverem sido inoculados, faça o ciclo do tubo de inóculo de volta para a câmara anaeróbica. Preparar e plaquear outra diluição em série, conforme descrito no passo 1.5. Esta é a UFC pós-inoculação. Comparar as UFC das placas pós-inoculação e pré-inoculação para determinar se a viabilidade do inóculo diminuiu enquanto estava fora da câmara anaeróbia durante a inoculação dos animais.
   5. Coloque as lavagens vaginais coletadas na etapa 2.2. em ágar seletivo (neste caso, 1 mg/mL de estreptomicina). Incubar as placas durante 1-2 dias numa câmara anaeróbica a 37 °C e examinar o crescimento. NOTA: O crescimento indica que os membros endógenos do microbioma são resistentes ao marcador de seleção e podem, portanto, obscurecer a enumeração de UFC do organismo alvo.
7. Coleta de lavagens vaginais para determinação de colonização viável por Gardnerella
   1. Colete as lavagens vaginais em pontos de tempo selecionados para analisar a colonização vaginal. Colete conforme descrito na etapa 2.2.
   2. Imediatamente após a coleta, faça o ciclo das lavagens vaginais em uma câmara anaeróbica. Use 10 μL de cada lavagem para realizar a diluição seriada e o plaqueamento em ágar seletivo, conforme descrito na etapa 1.5. Use as contagens de UFC como uma medida de colonização vaginal por Gardnerella (ou outro anaeróbio de interesse).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
β-estradiol 17-valerato	Sigma	E1631	Estrogenização de camundongos
1x PBS	Pescador	MT21040CM	lavagem vaginal, preparação do inóculo de G. vaginlalis , coleta e homogeneização de tecidos
Câmara anaeróbica	Tímido	7200000	Crescimento de bactérias anaeróbicas
Ágar-bacto	Pescador	DF0140074	Placas de ágar G. vaginalis, F. nucleatum e P. bivia
Glicose	Sigma	G7528	Meio NYCIII para crescimento de G. vaginalis
HEPES	Cellgro	25-060-CL	Meio NYCIII para crescimento de G. vaginalis
Soro de cavalo	Hemostato	SHS500	Meio NYCIII para crescimento de G. vaginalis
Mistura gasosa de hidrogênio (5% de hidrogênio, 10% de CO₂, 85% de nitrogênio)	Matheson		Gás para câmara anaeróbia
Purificador de água Milli-Q	Millipore	IQ-7000	para fazer mídia e homogeneização
NaCl	Sigma	S3014	Meio NYCIII para crescimento de G. vaginalis
Gás nitrogênio	Gás de ar		Gás para câmara anaeróbia
Pontas de filtro P-200	Biografia do ISC	Pág. 1237-200	lavagens vaginais e inoculações bacterianas
Óleo de gergelim	Pescador	ICN15662191	Estrogenização de camundongos
Espectrofotômetro	BioChrom	80-3000-45	medindo OD₆₀₀ bacteriano
Estreptomicina	Gibco	11860038	adicionar ao meio de ágar para fazer placas seletivas
Extrato de levedura	Pescador	DF0127-17-9	Meio NYCIII para crescimento de G. vaginalis