Ensaio de inundação de mudas para triagem de resistência bacteriana em tomates

Resumo

Fonte: Hassan, J. A., et al. Identificação de alto rendimento de resistência a Pseudomonas syringae pv. Tomate em tomate usando ensaio de inundação de mudas. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra um método para rastrear a resistência bacteriana em diferentes cepas de tomate usando mudas de dez dias inoculadas com uma suspensão bacteriana. Ele explica como as bactérias invadem os estômatos, fornecem proteínas efetoras para suprimir a imunidade das plantas e como as respostas das plantas diferem entre cepas suscetíveis e resistentes. O resultado é avaliado pela observação de diferenças visíveis de crescimento, com plantas resistentes permanecendo saudáveis e suscetíveis apresentando danos teciduais.

Protocolo

1. Método de inundação de mudas de tomate

1. Retire as placas com as mudas de 10 dias da câmara de crescimento e coloque no gabinete de biossegurança para preparar as placas para inundações.
2. Remova a fita cirúrgica de duas placas.
3. Defina um cronômetro para 3 min. Meça 6 mL do inóculo final de P. syringae pv. tomate (Pst) (Pst19 OD₆₀₀ = 0,0075 ou PstDC3000 OD₆₀₀ = 0,005) e transferir 6 mL de inóculo para cada placa com as mudas de 10 dias de idade.
4. Empurre suavemente as mudas para baixo no inóculo com uma ponta de pipeta estéril. Inicie o cronômetro.
5. Segure um prato em cada mão. Incline a frente da placa para baixo para acumular inóculo e principalmente submergir os cotilédones e as folhas das mudas.
6. Agite de um lado para o outro 5–7x e, em seguida, incline as placas para trás para cobrir as raízes e toda a placa.
7. Incline as placas para baixo novamente para submergir os cotilédones e as folhas e repita por um total de 3 min.
8. Despeje o inóculo das placas, coloque-as em uma superfície plana e, em seguida, despeje qualquer inóculo residual uma segunda vez.
9. Embrulhe novamente as placas com fita cirúrgica e repita as etapas 1.2 a 1.8 para as placas restantes.
10. Incube novamente as placas na câmara de crescimento depois que todas as placas forem inundadas.

Fenótipo após 7–10 dias para PstDC3000 ou 10–14 dias para Pst19.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Armário de biossegurança, classe II tipo A2
MARCA Cubetas de plástico descartáveis, poliestireno	VWR Internacional	47744-642
Palitos de dente de madeira plana Chenille Kraft	VWR Internacional	500029-808
Pavio de vidro do queimador de álcool	Fisher Científico	S41898A / Não. W-125
Queimadores de álcool de vidro	Fisher Científico	S41898 / Nº. BO125
Reagente de glicerol ACS	VWR Internacional	EMGX0185-5
Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Limpadores de Tarefas Delicadas	Fisher Científico	06-666-A
Cloreto de magnésio, grau ACS	VWR Internacional	97061-356
Sulfato de magnésio heptahidratado, grau ACS	VWR Internacional	97062-130
Tubos de microcentrífuga, 1,5 mL
Tubos de microcentrífuga, 2,2 mL
Murashige & Skoog, Sais Basais	Laboratórios Caisson, Inc.	MSP01-50LT
Pipeta-Lite XLS LTS 8-CH Pipeta 20-200uL	Rainin	L8-200XLS
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipeta 2-20uL	Rainin	L8-20XLS
Placa de Petri estéril de poliestireno 100 mm x 25 mm	VWR Internacional	89107-632
Placa de Petri estéril de poliestireno 150mm x 15mm	Fisher Científico	FB08-757-14
Placa de Petri estéril de poliestireno 150x15mm	Fisher Científico	08-757-148
Pontas LTS 20 μL 960/10 GPS-L10	Rainin	17005091
Pontas LTS 250 μL 960/10 GPS-L250	Rainin	17005093