Entrega localizada de bactérias no lúmen intestinal de uma larva de peixe-zebra usando microinjeção

Resumo

Fonte: Li, J. et al. Desenvolvimento de um modelo de infecção larval de peixe-zebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a entrega baseada em microinjeção de Clostridioides difficile marcado com fluorescência no lúmen intestinal de uma larva de peixe-zebra anestesiada. Ele descreve as etapas envolvidas na preparação larval, injeção bacteriana e confirmação baseada em microscopia de fluorescência da localização bacteriana no intestino.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Injeção de Clostridioides difficile corado em larvas de peixe-zebra

1. Anestesiar 20-30 larvas de peixe-zebra 5 dias após a fertilização (referido aqui como 5 dpf) com 0,02% -0,04% de tricaína (o pó de tricaína é dissolvido em água bidestilada e ajustado para pH = 7 com solução 1 M Tris-HCL) em meio de 30% de Danieau ~ 10 min antes da injeção. Transfira as larvas anestesiadas para uma placa de Petri fresca de 10 cm e remova o excesso de meio de Danieau a 30%.
2. Coloque uma gota de agarose de baixo ponto de fusão a 0,8% nas larvas do peixe-zebra para cobrir. Ajuste suavemente as larvas para uma posição lateral. Coloque a placa de Petri no gelo por 30–60 s para permitir que a agarose de baixo ponto de fusão solidifique. Adicione 30% de meio de Danieau contendo 0,02% a 0,04% de tricaína para cobrir a agarose.
3. Prepare a solução injetável. Adicione 1 μL de vermelho de fenol a 0,5% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em 9 μL do inóculo de Clostridioides difficile corado com corante para visualizar o processo de injeção.
4. Carregue uma agulha de microinjeção calibrada com a solução de injeção usando um microcarregador. Monte a agulha carregada em um micromanipulador e posicione-a sob um estereomicroscópio.
5. Ajuste a pressão de injeção entre 600–900 hPa. Defina o tempo de injeção para 0,1–0,3 s para obter 0,5–1,0 nL. Coloque a agulha no micromanipulador em um ângulo de ~45° apontando para as larvas embutidas.
6. Coloque a ponta da agulha acima do trato gastrointestinal, perto do poro urogenital. Perfure a agarose, depois o músculo com a ponta da agulha, insira-o no lúmen intestinal e injete 0,5–1,0 nL de Clostridioides difficile. Use um microscópio de fluorescência para monitorar as larvas injetadas e captar as larvas injetadas adequadamente para imagens confocais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Baixo ponto de fusão de agarose (LM)	Pronadisa	8050	É usado em placas de agarose
BacLight Mancha Bacteriana Vermelha	Thermo Fisher Científico	B35001	Corante fluorescente
Vidro capilar	Aparelho de Harvard	30-0019	Agulhas de injeção
Clostridioides difficile			R20291, uma cepa de ribotipo 027, produção de TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	Plataforma de código aberto		Processamento de imagem
Micro injetor	Eppendorf	5253000017
Microscópio confocal Leica SP8	Leica
Vermelho de fenol	Sigma-Aldrich	Pág. 0290
Tricaína	Sigma-Aldrich	E10521