Isolamento e Cultura de Bactérias Clostridioides difficile do Intestino Larval de Peixe-Zebra

Resumo

Fonte: Li, J., et. al., Desenvolvimento de um modelo de infecção larval de peixe-zebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o isolamento e a cultura da bactéria Clostridioides difficile do intestino de larvas de peixe-zebra. O intestino infectado é dissecado, homogeneizado e incubado em meio anaeróbico seletivo contendo antibióticos. Essas condições suprimem micróbios concorrentes e promovem o crescimento de células viáveis.

Protocolo

Dissecção do intestino larval de peixe-zebra para recuperar Clostridioides difficile viável

1. Isole o trato gastrointestinal das larvas para analisar a carga bacteriana. Comece sacrificando larvas de peixe-zebra com 0,4% de tricaína.
2. Lave o peixe-zebra brevemente com 1x PBS estéril (solução salina tamponada com fosfato) e transfira-o para um prato de agarose fresco.
3. Dissecação do peixe-zebra
   1. Insira uma agulha no tronco dorsal das larvas do peixe-zebra perto da cabeça para imobilizar o peixe-zebra. Remova a cabeça atrás das guelras com uma lanceta.
   2. Insira a segunda agulha no meio do tronco dorsal. Insira a terceira agulha no abdômen do peixe-zebra e puxe o intestino para fora da cavidade corporal.
      NOTA: É necessário extremo cuidado para isolar o intestino intacto. Se for difícil fazê-lo, faça puxões adicionais para separar o resto do intestino dos órgãos internos restantes.
   3. Use uma agulha de microinjeção para transferir 10 a 15 intestinos para um tubo de 1,5 mL contendo 200 μL de PBS estéril 1x.
   4. Homogeneizar os intestinos com um pilão para romper o tecido e preparar homogeneizados. Certifique-se de que o pilão atinja o fundo do tubo para interromper completamente todos os intestinos.
4. Incubar os homogeneizados em meio de criação de C. difficile contendo D-cicloserina e cefoxitina, com ou sem taurocolato (TCA, um germinante de esporos de C. difficile ) em uma câmara anaeróbica.
5. Incubar a placa anaeróbia durante 48 h a 37 °C.

Materiais