Renascimento e crescimento de bactérias lácticas

Resumo

Fonte: Ayivi, R. et al., O cultivo, crescimento e viabilidade de bactérias do ácido lático: uma perspectiva de controle de qualidade. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o método para recuperar bactérias do ácido lático estressadas pelo frio de um estoque de glicerol congelado, restaurando a viabilidade bacteriana por meio de incubação anaeróbica e isolando colônias ativas para expansão da cultura.

Protocolo

1. Protocolo para ativação e controle de qualidade de culturas de bactérias do ácido lático (LAB)

1. Retire o estoque de glicerol preparado de cepas LAB (em tubos de centrífuga de 2 mL) do freezer ultrabaixo a -80 ° C e não permita que descongelem antes de usar.
2. Limpe e desinfete a abertura dos tubos da centrífuga com álcool 70% e bata suavemente antes de usar.
3. Pipete cerca de 250 μL (0,25 mL) da cultura LAB padrão dos tubos de centrífuga para tubos de ensaio MRS (meios deMan, Rogosa e Sharpe) frescos de 2 mL.
4. Agite suavemente, parafilme os tubos de ensaio e incube-os anaerobicamente durante a noite a 42 °C por 12-16 h.
5. Pegue cerca de 500 μL (0,5 mL) das culturas cultivadas durante a noite dos tubos de ensaio de 2 mL de MRS em tubos de ensaio frescos de 7 mL de MRS, em vórtice, e incube-os anaerobicamente durante a noite a 42 ° C por 12-16 h.
6. Avaliar o crescimento microbiano medindo a densidade óptica (DO) ou o crescimento das culturas a 610 nm com um espectrofotómetro UV-visível e registando resultados aceitáveis entre 0,7 e 0,9.
7. Risque as culturas noturnas dos tubos MRS de 7 mL em placas de ágar MRS e MRCM-PYR (meio clostridial reforçado modificado-piruvato) e incube-as anaeróbia por 72 h a 42 ° C.
8. As colônias isoladas são colhidas das placas de ágar, transferidas para tubos de ensaio MRS frescos de 7 mL, suavemente vórtices e incubadas anaeróbia durante a noite a 42 ° C por 12-16 h.
9. Conservar as placas de ágar-ágar contendo as estirpes isoladas a 4 °C no frigorífico durante uma semana.
10. Meça e confirme a DO (entre 0,7 e 0,9) dos tubos de ensaio MRS de 7 mL das culturas LAB isoladas das placas estriadas a 610 nm e use-as como culturas de trabalho para todos os experimentos relacionados.
11. Para obter uma proporção de 1:10, realize diluições de dez vezes (diluições em série) das culturas LAB cultivadas a partir dos tubos de ensaio MRS finais de 7 mL usando 9 mL de água peptonada (um tampão fisiológico).
12. Finalmente, pegue cerca de 250 μL (0,25 mL) de diluições seriadas apropriadas para todos os experimentos de fermentação.
13. Ativar o caldo contendo estirpes (250 μL) do passo 2.12, transferindo-os para um caldo fresco de 7 ml de MRS e incubando-os anaeróbios a 42 °C durante 16 h.
    NOTA: Todas as cepas de L. bulgaricus foram ativadas no caldo MRS recém-preparado e foram então incubadas anaeróbia a 42 ° C por 16 h para atingir uma densidade óptica (OD₆₁₀ nm) de crescimento bacteriano entre 0,7 e 0,9. O crescimento bacteriano foi medido com um espectrofotômetro UV-visível a 610 nm. Os valores de pH das culturas noturnas estavam na faixa de 3,5 a 5,3 como resultado da produção de ácido lático, um produto final orgânico da fermentação LAB. Procedimentos de segurança, como circulação adequada do fluxo de ar na capela de biossegurança e evitar queimaduras durante o uso do bico de Bunsen, foram respeitados e observados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Azul de anilina	Thermo Científico	R21526	25 gramas
Extrato de carne bovina	Produtos de Pesquisa Internacional	50-197-7509	500 gramas
Extrato de levedura	Fisher Científico	BP1422-500	500 gramas
Cloreto de cálcio di-hidratado	Fisher Científico	C79-500	500 gramas
Dextrose anidra	Fisher Científico	BP350500	500 gramas
D-frutose	ACROS Orgânicos	AC161355000	500 gramas
Ágar Difco em pó	Difco	DF0812-07-1	2 kg
Ágar TPY	Difco	211921	500 gramas
Tubo de microcentrífuga Eppendorf (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Científico	05-402-12	2 mL
Glicerol	Thermo Científico	PI17904	500 mL
Incubadora de CO₂ infravermelho	Forma Científica
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Coleção de Cultura Tipo Americana (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgária	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgária	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos (NCATSU)	DAW
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos (NCATSU)	E22
Lactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos (NCATSU)	RD2
Cloridrato de L-cisteína mono-hidratado	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 gramas
Maltose monohidratada	Fisher Científico	M75-100	100 gramas
Caldo MRS	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptona nº 3	Hach	50-199-6719	500 gramas
Fosfato de potássio dibásico (K₂HPO₄)	Produtos de Pesquisa Internacional	50-712-761	500 gramas
Acetato de sódio trihidratado	Fisher Científico	S220-1	1 kg
Cloreto de sódio	Fisher Científico	BP358-1	1 kg
Piruvato de sódio	Fisher Científico	BP356-100	100 gramas
Tubos de ensaio com tampas de rosca revestidas de borracha	Fisher Científico	FB70125150	25 x 150 milímetros
Pré-adolescente 80	Fisher Científico	T164-500	500 mL
Congelador ultra baixo	Tão baixo
Uracil	ACROS Orgânicos	AC157301000	100 gramas
espectrofotômetro UV-visível	Thermo Fisher Científico	Evolução 201
Vórtice Gênio 2	Fisher Científico
Extrato de levedura	Fisher Científico	BP1422-500	500 gramas
Etanol	Fisher Científico	T08204K7	4 L
Ácido clorídrico (6N (certificado), Fisher Chemical)	Fisher Científico	SA56-500	500 mL