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1. Inoculação de Microarrays de Polímeros com Bactérias
NOTA: Garanta uma boa técnica asséptica. Todo o manuseio das culturas deve ser realizado em ambiente estéril: seja usando um bico de Bunsen ou uma capela de fluxo. As culturas devem ser cultivadas com disponibilidade de oxigênio, meio de crescimento e temperatura ajustados às necessidades de cada espécie.
- Prepare culturas durante a noite inoculando 5 mL de caldo Luria-Bertani (LB: 10 g / L de bacto-triptona, 5 g / L de cloreto de sódio, NaCl e 10 g / L de extrato de levedura) com uma colônia de uma placa. Incubar durante a noite a 37 °C, agitando a 200 rpm (rotações por minuto).
- Preparar as existências congeladoras de culturas durante a noite por adição de glicerol (concentração total de 10%) e armazenar as reservas a -80 °C.
- Para determinar o número de células a partir de amostras dos estoques bacterianos descongelados, realize diluições em série de cada estoque e cultive as bactérias durante a noite em meio sólido. A determinação precisa do número de células nos estoques garante a inoculação adequada de cada espécie.
- Prepare o inóculo para o microarray. As culturas de uma única espécie são cultivadas como acima e aplicadas diretamente aos microarrays. BacMix-1 é uma mistura bacteriana de Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) e Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 é uma mistura bacteriana que consiste em Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus, K. pneumoniae e Enterococcus faecalis (E. faecalis).
- Para produzir uma ou outra cultura mista, misturar durante a noite em volumes iguais (3 ml cada) e diluir quatro vezes com LB fresco (até cerca de 50 ml de volume final).
- Coloque microarrays de polímero esterilizados por ultravioleta em placas retangulares de 4 poços e incube-os com 6 ml de culturas bacterianas mistas a 37 ° C com agitação suave (30 rpm) por 5 dias.
- Após a incubação, enxágue suavemente os microarrays duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM de cloreto de potássio, KCl, 10 mM de hidrogenofosfato dissódico, Na2HPO4, 1,8 mM de di-hidrogenofosfato de potássio, KH2PO4) e incube com uma solução de 1 μg / ml de coloração de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBS por 30 min.
- Lave as lâminas de microarray manchadas em uma placa de poço fresco, cobrindo com PBS e girando suavemente, trocando o PBS uma vez. Seque sob um fluxo de ar. Aplique uma lamínula de vidro na corrediça do microarray e sele no lugar com cola. Depois de seco, esterilizar a superfície externa com etanol a 70% (v/v).
- Descarte as culturas com segurança de acordo com seu nível de contenção.
2. Imagem e análise de microarray
- Capture imagens únicas para cada ponto de polímero em canais de campo claro e DAPI (Excitação/Emissão, Ex/Em = 358 nm / 361 nm). Execute isso manualmente com um microscópio fluorescente ou usando um microscópio de fluorescência automatizado (com uma platina XYZ controlada por um software de aquisição de imagem) equipada com uma objetiva de 20X.
NOTA: Ajuste o microscópio para obter imagens usando canais de campo claro e DAPI. Certifique-se de que o ganho e o tempo de exposição para captura de imagem para todos os microarrays sejam os mesmos. - Obtenha a intensidade média de fluorescência de cada ponto no canal DAPI escolhendo a área do ponto e quantificando a fluorescência com um software de processamento de imagem.
- Para a fluorescência de fundo de cada ponto, obtenha imagens dos pontos de polímero em um microarray replicado incubado apenas com meios sem bactérias. Deduza a fluorescência de fundo da intensidade do ponto para obter fluorescência de bactérias.
- Calcule o valor normalizado médio dos quatro pontos, representando cada polímero, usados para comparar a ligação de bactérias de vários polímeros.
- Identifique os polímeros que exibem a menor ligação bacteriana (menor fluorescência) como polímeros 'hit'.