Isolamento de bactérias resistentes a antibióticos de uma amostra de água para análise molecular

Resumo

Fonte: Ghadigaonkar, D. e Rath, A. Isolamento e Identificação de Bactérias Resistentes a Antibióticos Transmitidas pela Água e Caracterização Molecular de seus Genes de Resistência a Antibióticos. J. Vis. Exp. (2023)

Este vídeo demonstra o isolamento e a preparação de bactérias resistentes a antibióticos a partir de uma amostra de água usando meios seletivos. O DNA é extraído de bactérias resistentes a antibióticos e amplificado para identificar os genes bacterianos resistentes a antibióticos.

Protocolo

1. Coleta e processamento de amostras

1. Coleta de amostras
   1. Colete o volume apropriado da amostra de água em recipientes de amostra estéreis, certificando-se de que não mais do que 3/4 do recipiente esteja cheio.
   2. Transportar as amostras para o laboratório em condições assépticas o mais rápido possível após a coleta e processá-las imediatamente.
2. Processamento de amostras
   1. Filtre assepticamente a amostra de água através de um pano de musselina estéril para remover qualquer material particulado.
   2. Efectuar diluições em série adequadas da água filtrada para análise posterior.

2. Estimativa da carga bacteriana total e da contagem de bactérias resistentes a antibióticos

1. Determinação da carga bacteriana total
   1. Suspenda 18,12 g de pó modificado com ágar 2A da Reasoner (ágar R2A) em 1.000 mL de água bidestilada e dissolva a mistura por aquecimento. Autoclave a mistura dissolvida a 121 °C, 15 libras por polegada quadrada (psi) por 20 min. Prepare as placas modificadas com ágar R2A despejando a quantidade apropriada da mistura autoclavada em placas de Petri estéreis (por exemplo, adicione aproximadamente 20 mL de meio estéril autoclavado a uma placa de Petri estéril de 90 mm).
   2. Assim que o meio solidificar, espalhe uniformemente 100 μL das diluições apropriadas da amostra de água filtrada na placa modificada de ágar R2A. Execute o experimento em duplicata.
   3. Incubar todas as placas acima a 35-37 °C durante 48 h (variar a temperatura e o tempo de incubação dependendo do meio utilizado para o isolamento).
   4. Expresse a carga bacteriana total em termos de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) usando a equação (1):
2. Determinação da contagem bacteriana AR
   1. Siga as etapas 2.1.1-2.1.4. No entanto, em vez de ágar R2A, placas modificadas, use ágar R2A, placas modificadas suplementadas individualmente com cinco antibióticos diferentes, a saber, cefotaxima (3 μg / mL), ciprofloxacina (0,5 μg / mL), eritromicina (20 μg / mL), canamicina (15 μg / mL) e vancomicina (3 μg / mL).
   2. Adicionar os antibióticos separadamente em tubos contendo 20 ml de ágar R2A fundido estéril, modificado (com a temperatura do ágar R2A fundido, modificado a ≤40 °C) para atingir a concentração final de antibiótico mencionada no passo 2.2.1.
   3. Agite para misturar uniformemente e despeje em placas de Petri estéreis antes que o ágar solidifique. Execute o experimento em duplicata.
   4. Incubar todas as placas acima a 35 - 37 °C durante 48 h (a temperatura e o tempo de incubação podem variar se utilizar um meio diferente).
   5. Para controle de qualidade e verificação da eficácia dos antibióticos, espalhe 100 μL de suspensões bacterianas das cepas de Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 29213 em suas respectivas placas modificadas de ágar R2A contendo antibióticos (certifique-se de que a densidade da cultura fresca usada para a inoculação seja densidade óptica, OD = 0,5 a 600 nm).
   6. Determinar a contagem bacteriana resistente aos antibióticos em termos de UFC/ml, conforme descrito no passo 2.1.4.

3. Identificação de bactérias cultiváveis por sequenciamento do gene do RNA ribossômico 16S (rRNA)

1. Preparação de molde de DNA a partir dos isolados para reação em cadeia da polimerase (PCR)
   1. Usando um palito de dente estéril, pegue uma única colônia isolada e pura do isolado que cresce em uma placa de Petri. Suspender a colónia bacteriana em 100 μL de água bidestilada estéril num tubo de microcentrífuga estéril e ferver durante 10 min.
   2. Centrifugue a suspensão a 10.000 × g por 2 min para pellet os detritos e transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga estéril fresco para uso como molde bruto de DNA.
2. Amplificação de PCR direcionada da região V3 do gene 16S rRNA e sequenciamento
   1. Prepare 40 μL da mistura de reação em um tubo de PCR para amplificação por PCR, conforme mencionado na Tabela 1.
      NOTA: A preparação do DNA deve ser realizada em um bloco de gelo, minimizando a chance de contaminação (use luvas ao manusear os reagentes e limpe bem a superfície de trabalho com etanol a 70%).
   2. Coloque o tubo no bloco térmico e execute o programa apropriado no termociclador de PCR. Consulte a Tabela 2 para obter as condições padronizadas de ciclagem de PCR e as informações do primer para a amplificação das regiões V3 dos genes 16S rRNA.

Tabela 1: Constituintes do mastermix de PCR. A composição da mistura de reação de vários reagentes de PCR.

Reagentes de PCR	Volume (μL)
2x Taq Master Mix	20
Primer dianteiro (10 pico mole)	1.5
Primer reverso (10 pico mole)	1.5
Modelo de DNA bruto	1.5
Água estéril de biologia molecular	15.5
Volume total	40

 

 

 

 

 

 

 

Tabela 2: Condições do ciclo de PCR para amplificação do gene 16S rRNA. As condições do ciclo de PCR necessárias para a amplificação do gene 16S rRNA são mostradas. As etapas incluem uma etapa inicial de desnaturação, seguida por 35 ciclos de desnaturação, recozimento e extensão, e uma etapa final de extensão.

Direção	Sequência de primer 5 '- 3'	Condições de PCR	Não. de ciclos
Encaminhar	GGAGGCAGCAGTAAGGAAT	94 °C por 10 min	1
		Desnaturação a 94 °C durante 30 s	35
		Recozimento a 50 °C por 30 s
		Extensão a 72 °C por 40 s
Inverter	CTACCGGGGTATCTAATCC	Extensão final a 72 °C por 5 min	1

Materiais