Um sistema de co-cultivo para estudar as respostas moleculares de hospedeiros vegetais e bactérias em interação

Neste artigo

Resumo

Fonte: Nathoo, N., et al. Um sistema de co-cultivo hidropônico para análise simultânea e sistemática de interações moleculares e sinalização planta/micróbio. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra um sistema de co-cultivo hidropônico para estudar as interações planta-bactéria em condições estéreis. As mudas das plantas são transferidas para um meio de crescimento ácido estéril, incubadas e inspecionadas quanto à contaminação antes da inoculação com Agrobacterium. As bactérias ativadas se ligam às raízes das plantas, transferem o T-DNA para as células vegetais e promovem mudanças moleculares que aumentam a colonização bacteriana.

Protocolo

1. Sistema de co-cultivo hidropônico

Prepare o meio líquido de Murashige e Skoog (MS): 2,165 g / L de sais basais MS, 10 g / L de sacarose, 0,25 g / L de ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico (MES) e 59 mL / L de mistura de vitaminas B5, pH 5,75.
Autoclave o meio. Despeje 18 mL em cada vidro cilíndrico estéril ou tanque de plástico transparente (pratos cristalizantes, 100 x 80 mm2) com tampas estéreis.
NOTA: Pré-esterilize os tanques e tampas envolvendo-os em papel alumínio e autoclavando.
Em uma capela de fluxo esterilizada, use uma pinça estéril para transferir suavemente cada quadrado de malha com mudas de 10 a 14 dias do meio semissólido para um tanque cilíndrico hidropônico (Figura 1d). Sele as tampas nos tanques usando fita cirúrgica porosa.
Cultivar as plântulas na malha do tanque durante 72 h a 22-24 °C, com fotoperíodo de 16 h e agitação a 50 rpm para arejamento (Figura 1e).
NOTA: Isso permite que as plantas se adaptem ao ambiente hidropônico antes da inoculação (cocultivo) com microrganismos. Este período de espera também permitirá que a contaminação microbiana acidental seja aparente antes da inoculação.
1. Comece a próxima etapa no dia anterior ao final do período de incubação.
Cultivar Agrobacterium tumefaciens em meio agrobacterium (AB) (0,5% p/v de extrato de levedura, 0,5% p/v triptona, 0,5% p/v sacarose, 50 mM MgSO₄, pH 7,0) a 28 °C com agitação durante a noite até que a cultura atinja uma densidade óptica final de 1,0 a 600 nm (OD₆₀₀), medida usando um espectrofotômetro, com meio AB não inoculado como branco.
NOTA: Um OD₆₀₀ de 1,0 equivale a aproximadamente 10⁹ células/mL.
Lave o A. tumefaciens três vezes em um volume igual de 0,85% de NaCl. Ressuspender em igual volume de água bidestilada estéril.
Antes da inoculação, examine cuidadosamente o tanque com mudas para garantir que não haja contaminação; O meio nos tanques não contaminados deve ser claro e transparente.
1. Descarte qualquer tanque com líquido turvo (contaminação) e numere o restante dos tanques. Amostra de uma pequena quantidade (20 μL) de meio hidropônico de cada tanque numerado e localize-a em uma placa de Petri cheia de caldo Luria (LB). Incubar a cápsula a 28 °C.
Imediatamente, adicione 50 μL da suspensão de A. tumefaciens (aproximadamente 5 x 10⁷ células, estimadas a partir do OD₆₀₀) em cada tanque hidropônico numerado. Cocultive as mudas de Arabidopsis thaliana e A. tumefaciens a 22-24 ° C com um fotoperíodo de 16 h e agitando a 50 rpm (Figura 3f).
1. Examine a placa LB manchada da etapa 1.7.1. após 12 e 28 h de incubação para verificar a esterilidade dos tanques. Se houver alguma contaminação, não use o tanque numerado correspondente (inoculado com bactérias) para outros ensaios a jusante.
Se desejar, monitore o crescimento de A. tumefaciens em intervalos regulares, removendo uma amostra de meio do tanque e medindo o OD₆₀₀ usando um espectrofotômetro com meio de um controle não inoculado como um branco (Figura 2).
NOTA: Os sintomas da doença da planta devem ser aparentes após 7 dias (Figura 3).

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Resultados

Figura 1: Sistema de cocultivo hidropônico planta-micróbio. O painel esquerdo representa um fluxograma descrevendo as seis etapas principais na montagem e operação do sistema de co-cultivo hidropônico. O painel direito demonstra os materiais ex...