Preparação de E. coli Spheroplasts

Resumo

Fonte: Figueroa, D. M., et.al. Produção e visualização de esferoplastos e protoplastos bacterianos para caracterizar a localização de peptídeos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a produção de esferoplastos de Escherichia coli inibindo primeiro a divisão celular para induzir a filamentação, seguida pela digestão enzimática da parede celular. O processo inclui a adição controlada de um agente quelante, DNase, e um estabilizador osmótico para garantir a formação e estabilidade adequadas do esferoplasto para observação microscópica.

Protocolo

1. Preparação da solução

1. Preparar 1 M Tris-Cl, pH 7,8, dissolvendo 10,34 g de Tris HCl e 4,17 g de Tris OH em 50 ml de dH₂O num balão de 125 ml. Esterilizar filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 μm e armazenar num tubo cónico à temperatura ambiente.
2. Preparar a solução A (20 mM de MgCl₂, 0,7 M de sacarose, 10 mM de Tris-Cl, pH 7,8) dissolvendo 0,10 g de MgCl₂ (95,2 g/mol) e 11,98 g de sacarose (342,3 g/mol) em 25 ml de dH₂O num balão de 125 ml. Adicione 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e ajuste o volume para 50 mL. Esterilizar filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm co....

Resultados

Figura 1: Imagens representativas de E. coli. (A) Bactéria E. coli , (B) Cobra E. coli e (C) E. coli esferoplasto. As imagens foram .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Hidroclorito de Trizma (Tris HCl)	Sigma	T3253
Trizma base (Tris OH)	Sigma	T1503
Cloreto de magnésio	Sigma	M8266
Sacarose	Sigma	S7903
Lisozima	Sigma	L6876
Desoxirribonuclease I	Sigma	D4527
Ácido etilenodiaminotetracético	Sigma	106361	Utilizou 106361 Sigma no desenvolvimento do protocolo original; 106361 descontinuado com ED2SS como substituição
Hidrato de cefalexina	Sigma	C4895
Caldo de soja BBL Trypticase	Fisher Científico	B11768
Filtro de seringa Acrodisc de 25 mm com membrana Tuffryn HT de 0,2 μm	Corporação Pall	4192