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1. Preparação da solução
- Preparar 1 M Tris-Cl, pH 7,8, dissolvendo 10,34 g de Tris HCl e 4,17 g de Tris OH em 50 ml de dH2O num balão de 125 ml. Esterilizar filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 μm e armazenar num tubo cónico à temperatura ambiente.
- Preparar a solução A (20 mM de MgCl2, 0,7 M de sacarose, 10 mM de Tris-Cl, pH 7,8) dissolvendo 0,10 g de MgCl2 (95,2 g/mol) e 11,98 g de sacarose (342,3 g/mol) em 25 ml de dH2O num balão de 125 ml. Adicione 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e ajuste o volume para 50 mL. Esterilizar filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 μm e armazenar num tubo cónico à temperatura ambiente.
- Prepare a solução B (10 mM MgCl2, 0,8 M de sacarose, 10 mM de Tris-Cl, pH 7,8) dissolvendo 0,05 g de MgCl2 (95,2 g/mol) e 13,69 g de sacarose (342,3 g/mol) em 25 mL dH2O em um balão de 125 mL. Adicione 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e ajuste o volume para 50 mL. Esterilizar filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 μm e armazenar num tubo cónico à temperatura ambiente.
- Preparar sacarose 0,8 M dissolvendo 13,69 g de sacarose (342,3 g/mol) em 50 ml dH2O num balão de 125 ml. Esterilizar filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 μm e armazenar num tubo cónico à temperatura ambiente.
- Preparar 5 mg/ml de desoxirribonuclease I (DNase I) dissolvendo 0,015 g de DNase I em 3 ml de dH2O num balão de 50 ml. Esterilize filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 μm. Alíquota em tubos de microcentrífugas e conservar a -20 °C.
- Preparar ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,125 M, pH 8,0, dissolvendo 0,698 g de EDTA dissódico desidratado (372,2 g/mol) em 15 ml dH2O num balão de 125 ml. Esterilizar filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 μm e armazenar num tubo cónico à temperatura ambiente.
- Prepare 600 μg / mL de cefalexina dissolvendo 0,03 g de hidrato de cefalexina (365,404 g / mol) em 50 mL de dH2O em um balão de 125 mL. Esterilizar filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 μm e armazenar num tubo cónico a 4 °C.
- Preparar 5 mg/ml de lisozima dissolvendo 0,015 g de lisozima em 3 ml de dH2O num balão de 50 ml. Esterilize filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 μm. Alíquota em tubos de microcentrífugas e conservar a -20 °C.
- Prepare o caldo de soja tripticase (TSB) a 3% p / v dissolvendo 30 g de TSB em 1 L de dH2O em um balão de 2 L. Aliquotar a solução em frascos contendo 25 ml ou 100 ml de TSB para ser utilizado na preparação de esferoplastos de E. coli . Frascos de autoclave para esterilizar o meio líquido. O TSB estéril pode ser armazenado em temperatura ambiente ou 4 °C.
2. Preparação da cultura noturna
NOTA: Execute as seções 2-3 usando técnicas estéreis apropriadas. Se desejado, uma cepa bacteriana pode conter um plasmídeo para resistência a antibióticos para reduzir a contaminação potencial. Se estiver usando uma cepa com resistência a antibióticos, adicione os antibióticos necessários nas etapas 2.1 e 3.1 a 3.2.
- Prepare uma cultura durante a noite colhendo uma única colônia de bactérias usando uma ponta de pipeta estéril e colocando-a em um tubo de cultura de 14 mL contendo 2–3 mL de 3% p/v de TSB. Incubar a 37 °C, agitando durante 16–21 h.
3. Preparação de esferoplastos de E. coli Gram-negativos
- Num balão de 250 ml, diluir a cultura durante a noite 1:100 em 25 ml de volume de 3% p/v de TSB e incubar a solução bacteriana a 37 °C, agitando durante cerca de 2,5 h até que a solução atinja uma densidade óptica de 0,5–0,8 a 600 nm. Meça a densidade óptica usando um espectrofotômetro.
- Em um frasco de 250 mL, dilua esta cultura 1:10 em 30 mL de TSB a 3% p / v e incube a 37 ° C, agitando por 2,5 h na presença de 60 μg / mL de cefalexina (347,4 g / mol) para produzir filamentos de célula única de cerca de 50-150 μm de comprimento, que são observáveis sob ampliação de 1.000X usando um microscópio óptico ( Figura 1B ).
- Colha os filamentos centrifugando a solução bacteriana a 1.500 x g, 4 °C por 4 min. Decantar e descartar o sobrenadante, reservando o pellet.
- Lave os filamentos adicionando suavemente 1 mL de sacarose 0,8 M, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Incubar durante 1 min e, em seguida, eliminar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
- Adicione 150 μL de Tris-Cl 1 M (pH 7,8), 120 μL de lisozima 5 mg / mL, 30 μL de 5 mg / mL DNase I e 120 μL de EDTA 0,125 M em sua respectiva ordem ao pellet e incube a solução em temperatura ambiente por 10 min.
- Adicione 1 ml de solução A gradualmente durante 1 min à solução preparada em 3,5 utilizando uma micropipeta enquanto agita suavemente a solução com a mão. Incubar a solução durante 4 min à temperatura ambiente.
- Colocar 7 ml da solução B a 4 °C em dois tubos cónicos de 15 ml. Adicionar quantidades iguais da solução preparada em 3.6 a cada um destes dois tubos. Centrifugar a solução a 1.500 x g, 4 °C durante 4 min.
- Usando uma pipeta sorológica, remova cuidadosamente tudo, exceto 1-2 mL de sobrenadante, sem perturbar o pellet. Ressuspenda o pellet pipetando suavemente para cima e para baixo usando uma micropipeta P1000. Verifique visualmente a formação de esferoplastos observando a amostra com ampliação de 1.000X usando um microscópio de luz (Figura 1C).
- Armazene os esferoplastos a -20 °C por até uma semana ou até que tenham passado por 3 ciclos de congelamento e descongelamento.
