Geração de protoplastos a partir da bactéria Gram-positiva Bacillus megaterium

Resumo

Fonte: Figueroa, D. M., et al. Produção e visualização de esferoplastos e protoplastos bacterianos para caracterizar a localização de peptídeos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para gerar protoplastos a partir da bactéria Gram-positiva Bacillus megaterium.

Protocolo

1. Preparação da solução

1. Preparar 5 mg/ml de lisozima dissolvendo 0,015 g de lisozima em 3 ml de dH₂O num balão de 50 ml. Esterilize filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 μm. Alíquota em tubos de microcentrífugas e conservar a -20 °C.
2. Prepare o caldo de soja tripticase (TSB) a 3% p / v dissolvendo 30 g de TSB em 1 L de dH₂O em um balão de 2 L. Alíquota da solução em frascos contendo 100 mL de TSB para ser usado na preparação de protoplastos de B. megaterium . Frascos de autoclave para esterilizar o meio líquido. O TSB estéril pode ser armazenado em temperatura ambiente ou 4 °C.
3. Prepare a solução C (1 M de sacarose, maleato 0,04 M, 0,04 M MgCl₂, pH 6,5) dissolvendo 34,23 g de sacarose (342,3 g/mol), 0,46 g de ácido maleico (116,07 g/mol) e 0,38 g de MgCl₂ (95,21 g/mol) em 100 mL de dH₂O em um balão de 250 mL. Ajuste o pH para 6,5. Esterilizar filtrando através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 μm e armazenar num tubo cónico à temperatura ambiente.
4. Prepare 200 mL de meio protoplasto misturando 100 mL de TSB a 3% p / v e 100 mL de solução C em um frasco de vidro de 1 L. Autoclave para esterilizar a solução e armazenar em temperatura ambiente.

2. Preparação de protoplastos Gram-positivos de B. megaterium

1. Em um balão de 250 mL, diluir a cultura noturna 1:1.000 em 100 mL de TSB a 3% p / v e incubar a solução bacteriana a 37 ° C, agitando por aproximadamente 4,5 h até que a solução atinja uma densidade óptica de 0,9-1,0 a 600 nm. Meça a densidade óptica usando um espectrofotômetro.
2. Despeje a cultura líquida em dois tubos cônicos de 50 mL e centrifugue a 2.000 x g, 4 °C por 10 min.
3. Usando uma pipeta sorológica, descarte o sobrenadante de ambos os tubos cônicos. Ressuspenda cada pellet em meio protoplasto de 2,5 mL e combine as soluções ressuspensas em um único tubo cônico. Pipetar a solução ressuspensa combinada para um balão de 125 ml.
4. Adicione 1 ml de lisozima a 5 mg/ml e incube durante 1 h a 37 °C, agitando.
5. Monitore o crescimento de protoplastos com ampliação de 1.000x usando um microscópio óptico, observando quaisquer irregularidades, como bactérias que aparecem como bastonetes inchados em vez de esferas (Figura 1). Com uma pipeta serológica, transferir a solução para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 2.000 x g, 4 °C durante 10 min.
6. Transvase o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5 ml de meio protoplasto. Armazene os protoplastos a -20 °C por até uma semana ou até que tenham passado por 3 ciclos de congelamento e descongelamento.

Resultados

Figura 1: Imagens representativas de B. megaterium. (A) Bactérias B. megaterium e (B) B. megaterium protoplasto. As imagens foram tiradas com ampliação d...

Materiais