Avaliação da transcitose de E. coli através de monocamadas epiteliais intestinais

Resumo

Fonte: Islam, A., et al., Avaliação da Transcitose Intestinal de Isolados de Bacteremia Neonatal por Escherichia coli . J. Vis. Exp. (2023)

Este vídeo demonstra o procedimento para avaliar a transcitose de Escherichia coli neonatal em monocamadas epiteliais intestinais usando inserções transwell, medição de resistência elétrica e quantificação bacteriana.

Protocolo

1. Inoculação das células (início do experimento)

1. Após exatamente 2 h, remova as culturas bacterianas matinais do agitador e centrifugue-as por 10 min (1.900 x g, 4 ° C).
   NOTA: Para todas as etapas a seguir, mantenha todas as suspensões bacterianas no gelo para minimizar o crescimento.
2. Ressuspenda o pellet de bactérias no meio de cultura de tecidos (MTC) sem antibióticos. Use um espectrofotômetro para ajustar a densidade óptica (OD) para 0,7-0,9 e dilua ainda mais com TCM sem antibióticos para uma concentração de 1 x 10⁶ unidades formadoras de colônias (UFC) / mL (diluição de aproximadamente 1:100). Use esta suspensão bacteriana para infectar cada inserto com 1 x 10⁵ UFC por volume de 100 μL.
3. Rotule a placa transwell e infecte cada inserto com 100 μL do inóculo ajustado para OD (um total de 1 x 10⁵ UFC por inserto). O ensaio já começou. Anote a hora e registre-a como t = 0 h.
4. Colocar a suspensão bacteriana do inóculo em placas para quantificar o UFC/ml utilizando o método de diluição em pista, semeando alíquotas de 10 μL em placas quadradas de ágar LB.

2. Quantificando a transcitose

1. A cada 30 minutos após a inoculação, encha novos poços com 500 μL de MTC sem antibióticos. Transfira as inserções para esses novos poços usando um conjunto diferente de pinças estéreis para cada cepa bacteriana diferente.
2. Colete a mídia do poço coletor usado para cada inserção em tubos rotulados separados. Coloque esses tubos no gelo. Entre os pontos de tempo, retorne as placas transwell para a incubadora.
3. Para cada inserção, combine os meios coletados de t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h e t = 2 h e vórtice brevemente. Colocar os meios recolhidos em placas de ágar Luria-Bertani (LB) utilizando o método de diluição em pista para quantificar a quantidade de bactérias transcitadas nas primeiras 2 h do ensaio.
   NOTA: Recuperar as bactérias a cada 30 minutos e mantê-las no gelo minimiza o crescimento bacteriano nos poços coletores, e as medições são feitas em bactérias predominantemente transcitose.
4. Colocar as placas de ágar LB de diluição de pista rotuladas na incubadora bacteriana a 37 °C sem CO₂ suplementar e devolver a placa transwell T84 à incubadora de cultura de tecidos.
5. Em t = 4 h, repita a etapa 2.3 combinando os meios coletados de t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h e t = 4 h.
6. Em t = 6 h, repita a etapa 2.3 combinando o meio coletado de t = 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h e t = 6 h. Além disso, em t = 6 h, coloque a mídia dos poços de controle.

3. Fim do experimento

1. Medir e registar a resistência elétrica transepitelial (TEER) no final da experiência, t = 6 h.
2. Descontamine a sonda submergindo-a em etanol a 70% por 10-15 min. Se desejar, descarte as inserções ou salve/processe-as para aplicações adicionais. Deixe as placas de ágar LB incubarem durante a noite e desinfete e/ou descarte com segurança todos os outros materiais usados.
3. Após a incubação durante a noite, contar manualmente as colónias bacterianas nas placas LB de diluição em pista para determinar a quantidade de inóculo e a quantidade de transcitose de E. coli . Certifique-se de que as placas de controle não apresentem nenhum crescimento bacteriano.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos cônicos estéreis de 15 mL	MidSci	C15B
Tubos de microcentrífuga de 2 mL	Avant	AVSS2000
Tubos cônicos de polipropileno estéreis de 50 mL	Falcão	352070
Centrifuga	Sorvall	Lenda RT
Loops de inoculação descartáveis	Marca de pescador	22363605
Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco	11965-084
Medidor de Volt/Ohm Epitelial	Instrumentos de precisão mundiais	EVOM
Agitador para incubadora	New brunswick	Innova 4080
Incubadoras	Thermo Científico	51030284	Três deles são usados no método: um para cultura de tecido estéril, um para cultura de tecido infectado e um para incubação bacteriana.
Caldo de lisogenia	Difco	244610
Ágar caldo de lisogenia	IBI Científico	IB49101
Espectrofotômetro	Unico	1100RS
Células Intestinais T84	Coleção Americana de Cultura de Tecidos	CCL248
Insertos de cultura de tecidos, com membrana de treftalato de polietileno, poros de 3 μm, formato de 24 poços	Falcão	353096
Placa de cultura de tecidos, 24 poços	Falcão	353504