Este vídeo demonstra a preparação de uma cultura de Borrelia burgdorferi geneticamente modificada com DNA de bacteriófago dormente carregando um gene de resistência a antibióticos. Após a seleção e incubação de antibióticos, um indutor químico desencadeia danos ao DNA, levando à excisão, replicação e montagem de novos vírions contendo o gene de resistência. Após uma segunda centrifugação e ressuspensão, as células bacterianas que abrigam partículas virais maduras estão prontas para aplicações a jusante.
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Artigo de método
Preparação e Indução de Culturas de Borrelia burgdorferi para Produção de Partículas Virais
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26 de setembro de 2025
Neste artigo
Resumo
Protocolo
1. Preparação da cultura de B. burgdorferi para a produção de φBB-1
- Prepare o meio Barbour-Stoenner-Kelly suplementado com 6,6% de soro de coelho normal inativado pelo calor (BSK). Para 1 L de 1x BSK, combine os componentes listados na Tabela 1 em 900 mL de água, ajuste o pH para 7,6 usando hidróxido de sódio 1 N e misture lentamente a 4 ° C por 2-4 h. Após a mistura estar completa, verifique e reajuste o pH para 7,6 se necessário, e aumente o volume para 1 L com água. Esterilize o meio passando por um filtro de 0,22 μM (consulte a Tabela de Materiais) e use fresco ou armazene a 4 ° C por ≤2 meses.
- Três a cinco dias antes do início do protocolo de transdução, inocule 150 μL do(s) clone(s) apropriado(s) de B. burgdorferi em 15 mL de 1x BSK em tubos de centrífuga cônicos estéreis bem tampados (ver Tabela de Materiais). Suplementar o meio com a concentração adequada de antibióticos ou uma combinação de antibióticos para a seleção e manutenção de DNA heterólogo no(s) clone(s) de B. burgdorferi (s) (Tabela 2).
NOTA: B. burgdorferi é um organismo de nível 2 de biossegurança. Tome todas as precauções apropriadas ao trabalhar com este organismo. Realizar todo o trabalho com culturas vivas de B. burgdorferi em uma cabine de biossegurança classe II certificada e devidamente desinfetada. Descarte adequadamente todo o material que entre em contato com B. burgdorferi e os próprios organismos com base nas diretrizes dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC). - Incubar as culturas a 33 °C sem agitar até que as culturas atinjam uma densidade de ≥5 × 107 espiroquetas · mL−1, o que leva aproximadamente 3-5 dias.
3. Indução do fago B. burgdorferi φBB-1
NOTA: Esterilize todos os copos e plásticos em autoclavagem; esterilizar todas as soluções por autoclavagem ou filtração através de um filtro de 0,22 μM. As etapas abaixo são apresentadas com base em volumes de 15 mL, mas o método é escalável para volumes menores ou maiores, dependendo das necessidades individuais do experimento.
- Para a cultura de B. burgdorferi a partir da qual o fago será produzido (o doador), use a concentração calculada por qualquer método na etapa 2 para determinar o volume de cultura inicial necessário para produzir 4 mL de 2 × 108 espiroquetas · mL − 1. Isso produzirá uma concentração final de 5 × 107 espiroquetas · mL − 1 em 15 mL durante o estágio de recuperação (etapa 3.6 abaixo).
- Centrifugue o volume de cultura calculado na etapa 3.1 a 6.000 x g por 10 min. Transvase o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 4 ml de BSK fresco. Transfira a amostra para o tubo estéril mais pequeno disponível para conter a amostra com o mínimo de espaço livre.
- Adicione a quantidade apropriada de agente indutor à concentração recomendada (Tabela 3) com base em um volume de cultura de 4 mL para induzir a produção de fagos. Tampe bem o tubo e misture bem.
- Incubar a amostra a 33 °C durante 2-4 h.
- Após a incubação, transfira a amostra para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue a amostra a 6.000 x g por 10 min. Decantar o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet celular em 15 mL de 1x BSK.
Tabela 1: BSK para o cultivo e seleção de clones de B. burgdorferi para ensaios de transdução. A formulação e preparação de 1x BSK para cultivo de B. burgdorferi e 1,5x BSK para a seleção em fase sólida de clones de B. burgdorferi descritos aqui são baseados em Samuels. Diferentes formulações de BSK (ou MKP) que suportam o crescimento de B. burgdorferi ainda não foram testadas usando o ensaio de transdução.
| Componente | 1x BSK (para cultura) (1 L) | 1,5x BSK (para chapeamento) (1 L) |
| Albumina sérica bovina (fração V) | 35 gramas | 52,5 gramas |
| 10x CMRL-1066 (sem L-glutamina) | 8 gramas | 12 gramas |
| Neopeptona | 4 gramas | 6 g |
| leveduradura | 1,6 gramas | 2,4 gramas |
| HEPES | 4,8 gramas | 7,2 gramas |
| Glicose | 4 gramas | 6 g |
| Citrato de sódio | 0,56 gramas | 0,84 gramas |
| Piruvato de sódio | 0,64 gramas | 0,96 gramas |
| N-acetil-glucosamina | 0,32 gramas | 0,48 g |
| Bicarbonato de sódio | 1,76 gramas | 2,64 gramas |
| Soro de coelho normal inativado pelo calor (INRS) | 66 ml | 99 mL |
Tabela 2: Antibióticos potenciais e concentrações a serem usadas para a seleção e manutenção de DNA heterólogo em B. burgdorferi. Esta lista é baseada em marcadores atuais de resistência a antibióticos comumente usados em Borrelia burgdorferi. A canamicina, a gentamicina e a estreptomicina são preparadas em água, esterilizadas por filtro através de um filtro de 0,22 μM e armazenadas a -20 °C. A eritromicina é preparada em etanol a 95% e armazenada a -20 °C. Muitos laboratórios relatam o uso bem-sucedido de canamicina para seleção em uma concentração de 200 μg·mL−1; ao usar gentamicina e canamicina para seleção em ensaios de transdução, 400 μg·mL−1 de canamicina é usada. O gene aadA confere resistência à estreptomicina e à espectinomicina. Para a seleção de construtos contendo o gene aadA em E. coli, 100 μg·mL−1 de espectinomicina é usada. Observe que os aminoglicosídeos (canamicina, gentamicina e estreptomicina) não são clinicamente relevantes no tratamento da doença de Lyme; no entanto, a eritromicina é usada clinicamente em certas situações. Embora a resistência natural a este antibiótico em B. burgdorferi tenha sido relatada, este marcador de resistência não foi usado até agora nos ensaios de transdução relatados aqui.
| Antibiótico | Concentração de estoque | Concentração final na cultura de Bb |
| Canamicina | 100 mg.mL-1 (na água) | 200-400 μ g.mL-1 |
| Gentamicina | 50 mg.mL-1 (na água) | 50 μ g.mL-1 |
| Estreptomicina | 50 mg.mL-1 (na água) | 50 μ g.mL-1 |
| Eritromicina | 2 mg.mL-1 (em EtOH) | 0,06 μ g.mL-1 |
Tabela 3: Potenciais agentes indutores e concentrações usados para a indução de φBB-1 de B. burgdorferi. N-metil-N′-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), mitomicina C e etanol, bem como metanol e isopropanol, demonstraram induzir φBB-1 acima dos níveis constitutivos em B. burgdorferi cepa CA.11-2A. O MNNG é suspeito de ser cancerígeno e um risco ambiental; Use com cuidado, dissolva em um solvente combustível e incinere para descarte. A mitomicina C é suspeita de ser cancerígena e potencial risco ambiental; Use com cuidado sob uma capela de exaustão química e descarte adequadamente. Embora os dados publicados sugiram que o MNNG é o agente mais eficaz para induzir φBB-1, os perigos de trabalhar com esse produto químico e as dificuldades em adquiri-lo tornam seu uso complicado, principalmente entre os alunos. A indução com etanol é consistentemente melhor do que com metanol ou isopropanol e tem sido mais comumente usada no ensaio de transdução.
| Agente indutor | Concentração de estoque (solvente) | Concentração final na amostra |
| Etanol | 100% (nenhum) | 5% |
| Mitomicina C | 2 mg.mL-1 (água) | 20 μ g.mL-1 |
| 1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG) | 50 mg.mL-1 (DMSO) | 10 μ g.mL-1 |
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Unidades de filtro de 1 L (PES, tamanho de poro de 0,22 μm) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| Tubo de 12 mm x 75 mm (tampa de posição dupla) (polipropileno) | EUA Científico | 1450-0810 | comporta 4 mL com baixo volume de vazios (para indução) |
| Tubos de centrífuga cônicos de 15 mL (polipropileno) | EUA Científico | 5618-8271 | |
| 1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG) | Millipore Sigma | CUIDADO: potencial cancerígeno; não estão mais prontamente disponíveis, não testaram o substituto oferecido | |
| Pipetas Pasteur de 5,75" (com plugue de algodão/vidro borossilicato/não estéril) | Thermo Fisher Científico | 13-678-8A | autoclave antes do uso |
| Tubos de centrífuga cônicos de 50 mL (polipropileno) | EUA Científico | 1500-1211 | |
| Etanol absoluto | |||
| Bacto Neopeptona | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Levedurado | Gibco | 255772 | |
| Albumina de soro bovino (grau de reposição de soro) | Gêmeos Bio-Produtos | 700-104P | |
| CMRL-1066 sem L-Glutamina (pó) | Biológico dos EUA | C5900-01 | grau de cultura celular |
| Eritromicina | Produtos de Pesquisa International Corp | E57000-25.0 | |
| Solução de reagente de gentamicina | Gibco | 15750-060 | |
| Glicose (dextrose anidra) | Thermo Fisher Científico | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Científico | BP310-500 | |
| Sulfato de canamicina | Thermo Fisher Científico | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (tamanho de poro de 0,22 μM) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | para filtrar, esterilizar, antibióticos e outras soluções de pequeno volume |
| Mitomicina C | Thermo Fisher Científico | BP25312 | CUIDADO: potencial cancerígeno; Use apenas em uma capela de exaustão química |
| N-acetil-D-glucosamina | MP Biomédicos, LLC | 100068 | |
| Placa de Petri (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Científico | FB0875712 | |
| Soro de coelho não estéril com hemolisado (NRS) | Pel-Freez Biológicos | 31119-3 | inativar o calor de acordo com as instruções do fabricante |
| Bicarbonato de sódio | Thermo Fisher Científico | BP328-500 | |
| Piruvato de sódio | Millipore Sigma | Pág. P8674-25G | |
| Solução de sulfato de estreptomicina | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| Citrato trissódico di-hidratado | Millipore Sigma | S1804-500G | citrato de sódio para BSK |
