Detecção de um analito alvo usando um biossensor bacteriano

Resumo

Fonte: Barber, A. E., et al. Preparação e aplicação de um novo biossensor bacteriano para a detecção presuntiva de resíduos de arma de fogo. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra a detecção de analitos específicos usando um biossensor bacteriano. Uma cultura bacteriana carregando um plasmídeo com um gene de proteína fluorescente vermelha (RFP) sob um promotor sensível ao analito é coletada. Depois de limpar completamente a superfície de teste, uma pequena seção do lenço é imersa na cultura e incubada. A interação do analito com o promotor ativa a expressão de RFP, confirmando a presença do analito alvo.

Protocolo

NOTA: A síntese de E. coli expressando proteína fluorescente vermelha (RFP) é apresentada.

1. Preparação de ácido desoxirribonucléico plasmídeo (DNA) de E. coli

1. Descongele E.coli contendo um plasmídeo com um gene RFP e um gene de resistência à ampicilina e cultive a E.coli em placas de ágar Luria Broth (LB) contendo 100 μg / mL de ampicilina a 37 ° C por 24 h. Por exemplo, use o plasmídeo J10060 do registro de peças biológicas padrão usadas para biologia sintética (consulte a Tabela de Materiais). O plasmídeo J10060 inclui um gene para RFP sob o controle de uma região promotora de pBad e um gene de resistência à ampicilina. Em alternativa, transformar E.coli (ver passo 3.2) com o plasmídeo antes do crescimento nas placas de ágar LB.
2. Siga um protocolo de minipreparação padrão (consulte a Tabela de Materiais) para isolar o DNA de 1 mL de uma cultura de E. coli que contém o plasmídeo J10060. O objetivo do protocolo a seguir é remover o promotor pBad e substituí-lo pelo promotor desejado para o dispositivo.
3. Após a minipreparação do plasmídeo, armazene o DNA no freezer até que esteja pronto para a digestão.

2. Digestão enzimática de restrição

1. Configure a seguinte reação em um tubo de microcentrífuga para digestão de EcoRI e NheI: 10 μL de DNA de plasmídeo J10060 (isolado na etapa 1), 8 μL de água e 1 μL de enzimas EcoRI e NheI pré-misturadas com 1 μL de tampão (consulte a Tabela de Materiais).
2. Para o DNA promotor, estabeleça a seguinte reação em um tubo de microcentrífuga para digestão EcoRI e NheI: 10 μL de sequências de DNA promotor recozido (8 μL de água e 1 μL de cada uma das enzimas EcoRI e NheI pré-misturadas com 1 μL de tampão.
   1. Para antimônio (Sb-), chumbo (Pb-) ou trinitrotolueno (TNT)-RFP (consulte a Tabela de Materiais), dissolva os oligonucleotídeos em tampão [ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) 30 mM, pH 7,5; acetato de potássio 100 mM), incube em concentrações molares iguais, aqueça a 94 ° C por 2 min e resfrie gradualmente à temperatura ambiente).
3. Misturar as amostras pipetando suavemente para cima e para baixo com a pipeta regulada para 10 μl.
4. Incubar durante 30 min a 37 °C.
5. Inativar as enzimas a 80 °C durante 5 min.
6. Armazene o DNA digerido no freezer até que esteja pronto para a próxima etapa.

3. Ligadura e transformação

1. Ligadura
   1. Usando o plasmídeo e o DNA promotor que foram duplamente digeridos com EcoRI e NheI na etapa 2, configure a mistura de reação mostrada na Tabela 1 em um tubo de microcentrífuga no gelo; adicione o T4 DNA Ligase por último. NOTA: A Tabela 1 mostra uma ligação usando uma proporção molar de 1:3 vetor para inserir os tamanhos de DNA indicados.
   2. Misture suavemente a reação pipetando para cima e para baixo e microcentrifugue brevemente.
   3. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
   4. Inative o calor a 65 °C por 10 min.
2. Transformação
   1. Descongele um tubo com 20 μL de células de E. coli competentes em DH5-alfa no gelo até que os últimos cristais de gelo desapareçam.
   2. Adicione 5 μL de DNA de plasmídeo à mistura de células. Agite cuidadosamente o tubo 4-5 vezes para misturar as células e o DNA.
   3. Coloque a mistura no gelo por 2 min.
   4. Choque térmico a exatamente 42 °C por exatamente 30 s. Não misture.
   5. Coloque no gelo por 2 min. Não misture.
   6. Pipete 380 μL de caldo super ideal à temperatura ambiente com repressão catabólica (SOC) na mistura. Espalhe imediatamente em uma placa de ágar LB contendo ampicilina (100 μg / mL) e incube durante a noite a 37 ° C.
   7. Verifique as placas dentro de 24 h quanto ao crescimento.
   8. Sele as placas com filme de vedação e guarde-as na geladeira até que estejam prontas para a próxima etapa.

4. Reação em cadeia da polimerase de colônias (PCR)

1. Adicione a um tubo de PCR (configure 4 tubos de reação) as misturas de reação mostradas na Tabela 2.
2. Misture suavemente as reações pipetando para cima e para baixo.
3. Usando uma ponta de pipeta amarela, raspe uma colônia (ou região muito pequena) da E. coli transformada. Transfira um toque desta E. coli para uma nova placa LB / ampicilina / ágar que foi seccionada e, em seguida, insira a ponta da pipeta no tubo de PCR. Agite a ponta da pipeta para misturar a E. coli com a mistura de PCR. Repita mais três vezes para colônias adicionais. Transfira os tubos de PCR para uma máquina de PCR e inicie o termociclo usando o programa mostrado na Tabela 3.
4. Execute a eletroforese em gel usando um gel de agarose a 2% em TAE 9Tris-Acetato-EDTA) para determinar quais colônias têm a melhor ligação ao plasmídeo e cultive essas colônias em uma nova placa.
5. Guarde as placas na geladeira até que estejam prontas para o teste. Preparar uma cultura líquida em caldo Luria com 100 μg/ml de ampicilina adicionada para testes químicos.

5. Sequenciamento de DNA

1. Para cada amostra, adicione 5 μL de plasmídeo, 4 μL do primer de sequenciamento e 3 μL de água deionizada.
2. Coloque essa mistura em um tubo e envie-a para sequenciamento de DNA (consulte a Tabela de Materiais).
3. Analise os dados da sequência de DNA para comparar as sequências de DNA esperadas e observadas usando o software de análise de sequência de DNA para garantir que não haja mutação e que os genes foram inseridos corretamente.
   NOTA: O uso de E. coli como sensor químico é apresentado abaixo.

6. Preparação de culturas de E. coli

1. Prepare LB com 100 μg / mL de ampicilina para culturas líquidas.
2. Prepare culturas líquidas das bactérias sensoras, das bactérias de controle positivo* e das bactérias de controle negativo**.
   NOTA: *Bactérias de controle positivo: E. coli contendo um plasmídeo com o gene RFP sob controle de um promotor constitutivo; O plasmídeo E1010 do registro de peças biológicas padrão usadas para biologia sintética (ver Tabela de Materiais) foi usado neste trabalho.**Bactérias de controle negativo: E. coli contendo um plasmídeo com o gene RFP sob controle de um promotor diferente, como o promotor pBad (plasmídeo J10060 do registro de peças biológicas padrão usadas para biologia sintética (ver Tabela de Materiais) ou um plasmídeo que não possui o gene RFP.
3. Colocar as culturas numa incubadora agitável a 37 °C e 220 rpm durante um mínimo de 8 h e máximo de 18 h. Caldo turvo indica crescimento bacteriano.

7. Titulando E. coli para verificar a função do dispositivo

NOTA: Uma vez que os sensores tenham sido ajustados para verificar a função, esta etapa não precisa ser repetida. Um controle positivo na forma de adição de chumbo, antimônio e 2,4-DNT ou 1,3-dinitrobenzeno (1,3-DNB) pode verificar a função dos dispositivos para cada uso sem a necessidade de titulação completa.

1. Preparar uma solução-mãe da(s) substância(s) a analisar reconhecida(s) numa concentração de 10 ppm em água. Se a solubilidade for um problema, use uma mistura 50/50 de água / metanol.
2. Usando a Tabela 4 como guia, rotule o número apropriado de tubos de cultura estéreis e coloque 2 mL do caldo cultivado (da etapa 6 do protocolo) em cada tubo.
   NOTA: Para determinar uma faixa analítica geral, faça pelo menos três níveis diferentes de um analito com as bactérias sensoras, um nível com o controle negativo e um nível com o controle positivo. Também deve haver um tubo de cada uma das bactérias que não tenha adição de metal (outro tipo de controle negativo). Para determinar com mais precisão a faixa analítica e os limites de detecção, use uma faixa maior de concentrações de analitos.
3. Adicione a solução estoque de analito aos tubos contendo 2 mL de caldo conforme observado na Tabela 4, coloque as tampas de pressão no tubo de cultura de modo que fiquem soltas (para permitir o fluxo de ar para dentro do tubo) e vortex o tubo de cultura.
4. Deixar as tampas de pressão frouxamente nos tubos de cultura e colocá-las numa incubadora agitável a 220 rpm e 37 °C durante pelo menos 24 h.
5. Remova os tubos da incubadora, encaixe bem as tampas nos tubos e guarde os tubos na geladeira até que estejam prontos para a análise de fluorescência.

8. Usando E. coli como um sensor químico para resíduos de armas de fogo (GSR)

1. Usando um lenço à base de etanol projetado para remover chumbo (consulte a Tabela de Materiais), limpe todas as superfícies das mãos, inclusive entre os dedos. Use um lenço separado para cada mão. Armazene os lenços em um saco lacrado devidamente rotulado até a análise.
2. Para superfícies a serem testadas, use um lenço à base de álcool para superfícies grandes ou um cotonete umedecido com etanol para superfícies pequenas.
   NOTA: Para demonstrar a resposta dos sensores ao GSR, o interior de um invólucro de cartucho calibre .40 gasto foi esfregado com um cotonete umedecido com etanol.
3. Usando luvas limpas e tesouras limpas com álcool, corte uma seção de aproximadamente 1 cm² do centro do lenço.
4. Coloque o pedaço cortado do lenço umedecido ou o cotonete diretamente em um tubo de cultura que contenha 2 mL da bactéria sensora, garantindo que fique submerso no caldo.
5. Proceda conforme descrito acima nas etapas 7.4 – 7.5.

Tabela 1. Mistura de reação para ligadura, etapa 3.1.1 do protocolo.

COMPONENTE	REAÇÃO DE 20 μL
10X T4 DNA Ligase Tampão	2 μL
DNA de plasmídeo (3 kb)	3 μL
DNA do promotor (0,7 kb)	10 μL
Água livre de nuclease	4 μL
T4 DNA Ligase	1 μL

 

 

 

 

 

 

Tabela 2. Misturas de reação para PCR de colônias, etapa 4.1 do protocolo.

Componente	Reação de 25 μL
Primer direto de 10 μM	0,5 μL
Primer reverso de 10 μM	0,5 μL
UmTaq 2X Master Mix	12,5 μL
Água livre de nuclease	11 μL

 

 

 

 

 

Tabela 3. Parâmetros de termociclagem de PCR para a etapa 4.3 do protocolo.

PASSO	TEMP	HORA
Desnaturação Inicial	94 °C	30 s
30 Ciclos	94 °C	30 s
	55 °C	45 s
	68 °C	60 s
Extensão final	68 °C	5 min
Segurar	4 °C

 

 

 

 

 

 

 

Tabela 4. Configuração geral do experimento para titulação de biossensores, etapa 7.2 do protocolo.

ID do tubo	Bactéria	Concentração da solução da substância a analisar adicionada (ppm)	Metal adicionado	Volume de solução analita adicionado a 2.000 μL de caldo	[analito], ppb
1	PbRFP	10	Pb	2.5	12
2	PbRFP	10	Pb	75	361
3	PbRFP	10	Pb	150	698
4	PbRFP	0	nenhum	0	0
5	RFP neg	10	Pb	10	50
6	RFP pos	10	Pb	10	50

Materiais