Ensaio de enxame para visualização da motilidade da superfície bacteriana

Resumo

Fonte: Morales-Soto, N. et. al., Preparação, Imagem e Quantificação de Ensaios de Motilidade de Superfície Bacteriana. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra um ensaio de enxame usando bactérias que expressam proteína fluorescente verde para observar a motilidade da superfície em ágar macio. A imagem de lapso de tempo captura a expansão coordenada e a formação de gavinhas, destacando a motilidade da superfície bacteriana.

Protocolo

1. Preparação e inoculação de meios de ensaio de enxame

1. Preparação de mídia
   NOTA: A composição do meio descrita abaixo é aplicável aos estudos de formação de gavinhas de Pseudomonas aeruginosa . Consulte as especificações do meio na Tabela 1 para ensaios de motilidade superficial de Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e Myxococcus xanthus .
   1. Misture 200 ml de meio de enxame de biorreator aeróbico fluidizado (FAB) -menos sulfato de amônio ((NH4) ₂SO₄) (Tabela de Materiais), 0.9 g de ágar Noble e 0.2 g de ácidos Casamino (Tabela 1) mexendo com uma barra de agitação magnética. Use pequenos volumes (100-300 ml) para melhorar a consistência entre os experimentos.
   2. Autoclave a mistura de ágar/meio de 200 ml usando um tempo de exposição de 22 min, temperatura de exposição de 121,1 °C e uma opção de ventilação rápida. As configurações da autoclave permitirão a esterilização adequada e o derretimento do ágar, mas evitarão a caramelização do ágar.
      NOTA: O ágar nobre é propenso à caramelização; A motilidade bacteriana é alterada no ágar caramelizado.
   3. Imediatamente após a finalização do ciclo de esterilização, feche a tampa do frasco de mídia para evitar a perda de água por evaporação. No entanto, observe que a tampa apertada pode causar um efeito semelhante ao de "vedação a vácuo" na garrafa.
   4. Resfrie o meio a 50 °C enquanto agita à temperatura ambiente (RT) e adicione 2 ml de glicose estéril 1,2 M. Em alternativa, coloque o meio numa incubadora ou banho-maria a 60 °C até estar pronto a usar (até 15 horas mais tarde) e proceda conforme indicado. Para evitar a formação de bolhas no meio, misture bem usando a barra de agitação magnética; bolhas na superfície do ágar impedirão até mesmo a enxameação.
      NOTA: Para outros ensaios, adicione componentes sensíveis ao calor que não podem ser autoclavados, como nutrientes ou corantes adicionais, nesta etapa, conforme necessário (por exemplo, 8 μl de corante Invitrogen Syto 63 por 100 ml de ágar derretido para obter uma imagem de M. xanthus, conforme mostrado em Resultados Representativos, abaixo). A adição de alguns corantes pode afetar o comportamento de enxameação da linha de base, que deve ser verificado em relação a um controle sem corante.
   5. Em uma coifa de laboratório, alíquota de 7,5 ml de meio estéril por placa de Petri de poliestireno de 60 mm de diâmetro e manter as placas em uma única camada (não empilhada). Para uma superfície de enxameação maior, alíquota de 25 ml de meio por placa de Petri de 100 mm de diâmetro. É importante encher a louça em uma superfície horizontal plana. Use um nível de alvo para verificar se a superfície está nivelada.
      NOTA: Para ensaios de P. aeruginosa , o uso de um volume de meio específico por placa melhorará a consistência e a reprodutibilidade. Para os ensaios de B. subtilis e M. xanthus , o vazamento manual produz resultados comparáveis às alíquotas de volume específico.
2. Cura de placas
   1. Para placas pequenas (60 mm), deixe o meio de ágar derretido curar (tanto o líquido semi-sólido quanto o excesso seco) no exaustor descoberto (ou seja, sem tampas) por 30 min. Placas maiores (100 mm) requerem um tempo de cura mais longo (ver Discussão).
      NOTA: Alternativamente, alguns ensaios podem exigir que as placas curem na bancada durante a noite (20-24 horas) cobertas (ou seja, com as tampas abertas) em uma única camada (Tabela 1). A enxameação é sensível ao excesso e à umidade inadequada. A umidade, o fluxo de ar e a temperatura de qualquer laboratório podem exigir variação na cura da placa para promover a enxameação ideal de sua bactéria.
   2. Inocular as placas imediatamente após o término do período de secagem. Não guarde as placas para uso posterior.
      1. Realize o "teste de propagação de tinta" identificando uma placa de teste com uma mistura de 10 μl de tinta preta Higgins à prova d'água a 0,50% (vol/vol) e inóculo bacteriano. Se a mistura de tinta/inóculo se espalhar facilmente (ou seja, não retiver a forma de gotículas) na superfície da mídia, a mídia precisará de mais tempo para secar.
         NOTA: Para espécies que são particularmente sensíveis à umidade (por exemplo, P. aeruginosa), faça um rápido "teste de propagação de tinta" para determinar se as placas estão secas o suficiente.
3. Inoculação de ensaio de enxame
   1. Inocular 6 ml de meios de cultura em caldo (ver mais pormenores no quadro 1 ) com uma colónia isolada de uma cultura em placas de caldo de lisogenia (LB) fresca (< 5 dias se deixada à temperatura ambiente). Incubar culturas de caldo durante a noite (≤18 h) a 30 °C ou 37 °C com agitação horizontal (240 rpm).
   2. Inocule as placas de enxame manchando com 1-5 μl de cultura de caldo durante a noite ou "cutucando" o ágar com um palito de dente estéril ou agulha de inoculação de arame.
      NOTA: Preferimos o último método porque diminui a probabilidade de respingos no inóculo e evita a adição de umidade adicional à área de superfície do enxame.
4. Incubação de ensaio de enxame
   1. Para um ensaio geral, incubar placas de ensaio de enxame a 30 °C ou 37 °C (ou mesmo 42 °C para B. subtilis; Tabela 1) - isso é específico da bactéria. Inverta as placas durante a incubação para que o excesso de umidade se condense na tampa, não no ágar.
      NOTA: A temperatura pode afetar o fenótipo e a cinética. Para enxames de P. aeruginosa , a incubação a 37 ° C leva a um crescimento mais rápido e expansão do enxame do que a incubação a 30 ° C; no entanto, a morfologia desses enxames geralmente difere com essa mudança de temperatura.
   2. Para imagens de lapso de tempo, incube as placas de enxame na temperatura apropriada antes de transferi-las para a estação de imagem (consulte a Tabela 1 para obter detalhes).
      NOTA: Essa incubação pré-imagem permite que os enxames iniciem seu desenvolvimento e se estabeleçam antes de serem movidos para um novo ambiente, que pode ou não ser ideal para a motilidade do enxame.

2. Imagem macroscópica de ensaios de motilidade superficial

1. Para imagens de lapso de tempo, após o período de incubação pré-imagem, coloque as placas de ensaio de enxame em uma placa de imagem transparente dentro de uma estação de imagem comercial in vivo . Imagem de até seis placas de 60 mm de diâmetro ou quatro placas de 100 mm de diâmetro por vez. Como a câmera captura imagens abaixo do plano de imagem, inverta as placas para que o caminho óptico não seja obstruído. Em alternativa, incubar a 30 °C ou 37 °C (Quadro 1) durante a experiência e remover as placas a serem visualizadas da incubadora em intervalos de tempo definidos.
2. Coloque as tampas das placas de Petri na vertical em cima da contraparte da placa que contém o meio inoculado. Encha as tampas das placas de Petri com água para evitar a secagem excessiva durante a imagem e envolva toda a configuração usando outra bandeja transparente para manter a umidade durante todo o experimento.
3. Usando o software Molecular Imaging (MI), execute o(s) ensaio(s) à temperatura ambiente usando as configurações de imagem descritas na Tabela 2. Para imagens de lapso de tempo, configure um protocolo com as etapas e especificações necessárias.

Tabela 1: Especificações para preparação do ensaio de motilidade superficial. Inclui especificações de preparação de ensaio de motilidade superficial para P. aeruginosa, B. subtilis e M. xanthus.

	P. aeruginosa	Estudos de formação de gavinhas de P. aeruginosa	B. subtilis	M. xanthus
Meios de cultura de caldo durante a noite	FAB mais 30 mM de glicose	FAB mais 30 mM de glicose	LB	CTT (mídia complexa)
Temperatura de incubação da cultura de caldo durante a noite	37 °C	37 °C	37 °C	30 h a 30 °C
Mídia de enxame	FAB	FAB menos (NH4)2SO4	2% (peso / vol) LB	CTT
Mídia de enxame: componentes adicionais	12 mM Glicosea	10% (peso / vol) Ácidos de casamino (CAA), 12 mM Glicosea	n/a	SYTO® 64a
Tipo de ágar	Ágar, Nobre	Ágar, Nobre	Ágar granulado	Agar, Noble Affymetrix
Concentração de ágar (wt/vol)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
Tamanho da placa de enxame	60 milímetros	60 milímetros	100 milímetros	150 milímetros
Volume de mídia por placa	7,5 ml	7,5 ml	Derramado à mão	Derramado à mão
Método de configuração/secagem do meio de enxame	Capô; placas descobertas	Capô; placas descobertas	Placas de bancada cobertas	Placas de bancada cobertas
Configuração do meio de enxame/tempo de secagem	30 min	30 min	Pernoite (20 -24 horas)	Pernoite (20 -24 horas)
Temperatura de incubação do ensaio de enxame	30 ou 37 °C	30 °C	37 °C	30 °C
Incubação para imagens de lapso de tempo	30 °C durante pelo menos 4 horas	30 °C durante pelo menos 4 horas	37 °C por 2 horas	RT por 12 horas
Comprimento da captura de lapso de tempo	24 horas	24 horas	10 horas	66 horas
Configuração de lapso de tempo	1 quadro/10 min	1 quadro/10 min	1 quadro/6 min	1 quadro/10 min
a Adicionado após a autoclavagem.

 

Tabela 2: Especificação de imagem. Especificações da estação de imagem Bruker para imagens de fluorescência e luminescência vermelha e verde do crescimento da superfície bacteriana.

Sinal	Fluorescência verde	Fluorescência Vermelha I	Fluorescência Vermelha II	Luminescência
Proteína ou corante	Proteína Fluorescente Verde (GFP)	mProteína de cereja ou coloração de ramnolipídios vermelho-do-nilo	SYTO® 64	Luciferase do operon lux
Comprimento de onda de excitação (nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	Desligado
Comprimento de onda de emissão (nm)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	Sem filtro
Tempo de exposição (seg)	30	60	60	240
parada f	4.0	4.0	2.5	1.1
FOV (mm)	190	190	140	120
Plano focal (mm)	27.5	27.5	12.2	4
Binning (pixels)	Nenhum	2 x 2	Nenhum	8 x 8

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes:
Mídia mínima FAB:				Prepare-se a cada ~ 4 semanas. Topo para 1 L com nanopure H2O.
(NH4)algarismoENTÃO4	Sigma	A4418	2 g	Não utilizado em estudos de formação de gavinhas de P. aeruginosa .
Na2HPO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	S9390	9 gramas
KH2PO4	Sigma	Pág. 5655	3 gramas
NaCl	BDH	BDH8014	3 gramas
Solução de MgCl2 x 6H2O (198 g/L)	Fisher Científico	M33	1 ml
Solução de CaCl2 x 2H2O (14 g/L)	Fisher Científico	C79	1 ml
Oligoelementos de solução metálica (ver abaixo)	n/a	n/a	1 ml
Solução de traços metálicos:				Cubra a 1 L com nanopure H2O. Mantenha em uma garrafa de vidro, mexendo e coberta com papel alumínio.
CaSO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	255548	200 mg
MnSO4 x H2O	Sigma-Aldrich	M7634	20 mg
CuSO4 x 5H2O	Fisher Científico	C493	20 mg
ZnSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750	20 mg
CoSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	C6768	10 mg
NaMoO4 x 2H2O	Sigma	S6646	10 mg
H3BO3	Fisher Científico	Resposta 74	5 mg
FeSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	F7002	200 mg
Meios de comunicação dos CTT:				Prepare-se conforme necessário. Topo para 100 ml com nanopure H2O.
Tris-HCl, solução 1 M (ajustar para pH 8,0)	Amresco	234	1 ml	Preparar uma solução-mãe 1 M em H2O nano puro. Ajustar o pH para 8,0 e filtrar a esterilização (poro de 0,2 μm).
K2HPO4, 1 M solução (ajustar a pH 7,6)	Sigma-Aldrich	Pág. 3786	0,1 ml	Preparar uma solução-mãe 1 M em H2O nano puro. Ajustar o pH para 7,6 e esterilizar com filtro (poro de 0,2 μm).
Solução de MgSO4	Fisher Científico	M65	0,8 ml	Preparar uma solução-mãe 1 M em H2O nano puro. Esterilizar por filtro (poro de 0,2 μm).
Casitone	BD Diagnósticos	225930	1 g
Reagentes adicionais:
Caldo LB, Lennox	BD Diagnósticos	240230	2 % (peso em volume)
D-(+)-Glicose	Sigma-Aldrich	G5767	30 mM para culturas de caldo durante a noite; 12 mM para mídia de enxame	Prepare uma solução de estoque esterilizada com filtro de 1,2 M em H2O nano puro. Adicione ao meio após a autoclavagem.
Ácidos de Casamino (CAA)	Amresco	J851	0,10 % (peso em peso/vol)	Recomendado para estudos de formação de gavinhas de P. aeruginosa . Adicione à mídia antes da autoclavagem.
Ágar, Nobre	Sigma-Aldrich	Resposta A5431	0,45 % (peso / volume)	Ágar Noble preferido para estudos de motilidade superficial de P. aeruginosa . Adicione à mídia antes da autoclavagem.
Ágar, Nobre	Affymetrix	10907	1,50 % (peso / volume)	Usado em estudos de motilidade superficial de M. xanthus . Não recomendado para estudos de motilidade de P. aeruginosa . Adicione à mídia antes da autoclavagem.
Ágar granulado	Fisher Científico	BP1423	0,60 % (peso / volume)
Tinta preta à prova d'água Higgins	Higgins	HIG44201	0,50 % (vol/vol)	Misture tinta com inóculo para testar a umidade da superfície do meio de enxame.
Coloração fluorescente vermelha do ácido nucleico de SYTO® 64	Invitrogen	S-11346		Utilizar 4 μl (para P. aeruginosa) ou 8 μl (para M. xanthus) de SYTO® 64 por 100 ml de ágar fundido (adicionado após autoclavagem).
Materiais e equipamentos relevantes:
Placa de Petri, estéril, 150 mm x 15 mm (Diâmetro x A)	VWR	25384-326
Placa de Petri, estéril, 100 mm x 15 mm (Dia.x H)	VWR	25384-342
Placa de Petri, estéril, 60 mm x 15 mm (Dia.x H)	VWR	25384-092
In-Vivo Xtream	Bruker			Use para a imagem macroscópica de estudos de motilidade de superfície. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html