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1. Prepare instrumentos, meios de cultura, soluções e placas de Petri
1. Autoclave os palitos em um copo de 50 mL coberto com papel alumínio para mantê-los estéreis.
2. Esterilize todos os produtos secos que serão usados (pontas, palitos, copos, etc.) em autoclave.
NOTA: Cuidado! Siga todas as instruções de segurança para o modelo de autoclave usado. As autoclaves representam um risco de explosões, queimaduras por vapor e contato com superfícies, materiais e meios quentes.
3. Prepare o ágar MS (Farinha de Soja Manitol (SFM)) para cultivar culturas.
1. Adicionar 5 g de farinha de soja e 5 g de ágar a um balão de 1 litro.
2. Dissolva 5 g de manitol em 250 mL de água da torneira e distribua no frasco contendo a farinha de soja e o ágar.
3. Adicione um tampão de espuma e uma folha à abertura do frasco e autoclave a 121 °C, 15 psi durante pelo menos 30 min.
CUIDADO: Este meio transborda facilmente. Use um frasco que possa conter pelo menos quatro vezes o volume real de ágar MS sendo autoclavado. Uma panela de pressão padrão pode ser usada no lugar de uma autoclave com considerações de segurança semelhantes. Alternativamente, um forno de micro-ondas pode ser usado para esterilizar mídia e materiais se o acesso a uma autoclave não for possível. Os professores do ensino médio também podem querer colaborar com faculdades ou universidades locais para acessar suprimentos autoclavados.
4. Resfrie a mídia até ficar confortável o suficiente para manusear. Tenha cuidado para não resfriá-lo por muito tempo, pois o ágar-ágar solidifica em temperaturas abaixo de 50 °C.
5. Despeje o ágar MS do frasco em placas de Petri estéreis até que o fundo de cada placa de Petri esteja aproximadamente meio cheio (aproximadamente 25 mL de meio por placa de Petri). Deixe solidificar antes de usar placas de ágar. Armazene as placas de ágar em um saco plástico em temperatura ambiente até que sejam necessárias.
NOTA: As placas de ágar também podem ser armazenadas na geladeira, especialmente se forem necessários antibióticos na mídia.
2. Estrie Streptomyces em placas para propagação
1. Estrias Streptomyces em placas de ágar MS para colônias únicas usando um método padrão, como o método de listras de quadrante.
NOTA: Um laço inoculante ou palitos de dente estéreis podem ser usados. Opcional: Outros meios são comumente usados para espécies de Streptomyces , como R2YE e meios mínimos.
2. Incubar as placas a 30 °C.
3. Reliste as placas escolhendo uma única colônia a cada 4-6 dias. À medida que as colônias envelhecem, elas se tornam propensas a mutações aleatórias.
3. Compare e registre a aparência visual
1. Tome nota da morfologia da colônia para cada mutante em comparação com a cepa parental do tipo selvagem após listrar todas as cepas como na etapa 2. Compare o novo isolado com o de uma espécie bem estudada, como S. coelicolor ou S. venezuelae, ao caracterizar novas espécies de Streptomyces . Observe as características (Figura 1), como forma básica, superfície da colônia (difusa, careca, enrugada, etc.), opacidade, elevação e pigmentação (distinguir entre micélio vegetativo, micélio aéreo e/ou meio circundante).
2. Rotule uma placa de ágar MS e listre cepas selvagens e mutantes em padrões de cunha (Figura 1). Tenha cuidado para que nenhuma cepa toque outra cepa para evitar contaminação cruzada. Observe a data e a hora em que as cepas são riscadas na placa. Incubar as placas a 30 °C.
3. Coloque placas de Petri cultivadas em papel colorido ou branco para homogeneizar o fundo. Escreva no papel o nome da cepa, data, temperatura de incubação e tempo desde a primeira estria da placa. Tire uma foto digital da placa com as últimas informações escritas no fundo do papel para que a confusão seja minimizada.
NOTA: A escrita pode ser cortada da fotografia posteriormente se for usada para a preparação da figura.
