Microscopia de contraste de fase para avaliação de mutantes de desenvolvimento em Streptomyces

Abstract

Fonte: Bennett, J. A. et al. Avaliação visual e microscópica de mutantes do desenvolvimento de Streptomyces . J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o uso da microscopia de contraste de fase para examinar as diferenças fenotípicas entre o tipo selvagem e o mutante Streptomyces coelicolor. Ele descreve as etapas envolvidas na preparação e imagem de filamentos aéreos para detectar defeitos de desenvolvimento na formação de esporos.

Protocol

1. Realize microscopia de contraste de fase

1. Esterilize as pinças lavando em etanol a 70% e, em seguida, passando por uma chama de bico de Bunsen para evaporar o etanol. Deixe esfriar.
2. Esterilize as lamínulas lavando-as com etanol a 70% e deixando-as secar em uma placa de Petri estéril.
3. Prepare uma lamínula do crescimento bacteriano a ser examinado.
   1. Pegue uma lamínula estéril com uma pinça estéril e coloque a lamínula em uma placa de ágar manitol, farinha de soja (MS), onde o crescimento bacteriano de Streptomyces coelicolor é denso. Pressione suavemente a parte de trás da lamínula com uma pinça para garantir uma transferência suficiente de esporos bacterianos e micélio aéreo.
4. Pegue a lamínula da placa e coloque-a de forma que o lado com o material da célula fique voltado para a superfície de uma lâmina de microscópio, com uma gota de 15 μL de glicerol a 50% preparada em água para montagem. Reduza as bolhas de ar colocando a lamínula em um ângulo de 45° em relação à lâmina e deixando-a cair sobre o glicerol a 50%.
5. (Opcional) Sele com esmalte transparente para preservação da lâmina.
6. Realize microscopia de contraste de fase em vários intervalos de tempo durante os ciclos de vida.
   NOTA: Imagens repetidas permitem uma análise mais completa e a capacidade de detectar atrasos no desenvolvimento. Repita as observações de forma independente para garantir precisão e reprodutibilidade.
   1. Coloque a lâmina preparada no microscópio stage e adicione uma gota de óleo de imersão no centro da lamínula. Gire a objetiva de fase 100X no lugar e defina a torre do condensador para a configuração de fase de "correspondência" adequada. Foque a imagem usando apenas o botão de ajuste fino quando a lente objetiva estiver em contato com o óleo.
   2. Examine vários campos de visão para discernir diferenças perceptíveis e consistentes entre as cepas mutantes e o tipo selvagem, como a capacidade de formar esporos, tamanho e forma dos esporos e número total de esporos (ver Figura 1).
      NOTA: Alternativas à microscopia de contraste de fase incluem microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e técnicas simples de coloração para uso com microscópios de campo claro, como coloração violeta de cristal.

Results

Figura 1: Micrografias de contraste de fase mostrando um filamento aéreo representativo para cepas mutantes brancas de Streptomyces coelicolor contendo mutações aleatórias de inserção de transposons. (<...

Materials