Estabelecendo uma cultura binária de sacaribactérias com bactérias hospedeiras

Resumo

Fonte: Collins, A. J., et al., Estabelecendo Culturas Binárias Estáveis de Saccharibacteria Simbióticas da Cavidade Oral. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o estabelecimento e manutenção de uma cultura binária de Saccharibacteria e sua bactéria hospedeira, co-incubando-as sequencialmente em meio de crescimento específico do hospedeiro.

Protocolo

1. Concentrar células de Saccharibacteria por centrifugação
   1. Faça uma marca de orientação no tubo e na tampa e coloque o tubo em uma centrífuga de alta velocidade com a marca na parte superior. O pellet formado a partir da centrifugação é geralmente invisível. A marcação ajudará a determinar onde o pellet de células de Saccharibacteria está localizado quando a centrifugação for feita e o tubo for removido da centrífuga.
   2. Centrifugar as amostras a 60.000 x g durante 1 h a 4 °C.
      NOTA: Essa força e tempo são suficientes para pellet todas as células de Saccharibacteria. No entanto, as células de Saccharibacteria podem ser pelo menos parcialmente peletizadas por centrifugação por apenas 20 min a 20.000 x g.
   3. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga. Despeje o líquido do tubo, mantendo o pellet na parte superior do tubo.
   4. Ressuspenda o pellet geralmente invisível em 1-2 mL de tampão MRD (diluente de recuperação máxima) por vórtice vigoroso.

2. Infectar culturas de hospedeiros com filtrado enriquecido com Saccharibacteria

1. Prepare os tubos de cultura aliquotando 2 mL de meios de crescimento apropriados (por exemplo, TSBY (caldo de soja tríptico com 0,1% de extrato de levedura), BHI (Brain Heart Infusion), etc.) em tubos.
2. Adicione 200 μL da cultura noturna de organismos hospedeiros a cada tubo. Adicione 100-200 μL de amostra ressuspensa e filtrada a cada tubo.
3. Incubar amostras combinadas conforme apropriado para o organismo hospedeiro (por exemplo, 37 °C, em atmosfera aeróbia para Arachnia propionica).
4. Passe as células a cada dois ou três dias, transferindo 200 μL de cultura binária para 2 mL de meio de crescimento fresco em um novo tubo. Se parecer que as culturas passadas não mostram crescimento (ou seja, a turbidez / densidade óptica da cultura não aumenta após a passagem para o meio fresco), as Saccharibacteria podem estar sobrecarregando ou matando todos os organismos hospedeiros. Para remediar isso, adicione 200 μL de cultura hospedeira não infectada ao passar as células. Repita por pelo menos 5 passagens.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caldo de infusão de coração cerebral (pó desidratado)	Becton-Dickinson	211059	Ou outros meios de cultura adequados para organismos visados
Rotor de centrífuga 70-Ti	Beckman Coulter	337922
2 Porta-luvas Control InVitro	Laoratórios Coy	31615	Se necessário para organismos microaeróbicos
Centrífuga de alta velocidade Optima L-100 XP	Beckman Coulter	8043-30-1124
Micropipeta P-1000	Gilson	F123601G
Micropipeta P-200	Gilson	F123602G
PBS (solução salina tamponada com fosfato)	Fisher Científico	BP399500
Peptona	Fisher Científico	BP1420-500
Ponteiras de pipeta - 1000 μL	Fisher Científico	02-717-166
Ponteiras de pipeta - 200 μL	Fisher Científico	02-717-165
Tubos de centrífuga cônicos com tampa de rosca 15 mL	Falcão	352096	Ou outro tubo adequado para cultura bacteriana
Tubos de centrífuga de policarbonato de parede espessa de 25 x 89 mm (capacidade de 26,3 mL) com tampas	Beckman Coulter	355618
Placas de ágar sangue de soja tríptica	Serviços de Laboratório do Nordeste	Pág. 1100	Ou outra placa de ágar suficiente para o crescimento dos organismos hospedeiros
Caldo de Soja Tríptico (pó desidratado)	Becton-Dickinson	211825	Ou outros meios de cultura adequados para organismos visados
Extrato de levedura	Fisher Científico	BP1422-500