Subcultura de bactérias anaeróbicas redutoras de sulfito de uma cultura de ágar

Resumo

Fonte: Anwar, Z., et al. Enriquecimento e detecção de toxinotipos de Clostridium perfringens em amostras de alimentos para varejo. J. Vis. Exp. (2019).

Neste vídeo, bactérias redutoras de sulfito são cultivadas em um meio de ágar contendo sulfito, onde crescem anaeróbia e reduzem sulfito a sulfeto de hidrogênio, formando precipitados pretos com íons de ferro. As colônias negras são isoladas da profundidade do ágar usando técnicas assépticas e transferidas para meio fresco para incubação anaeróbica contínua.

Protocolo

NOTA: Clostridium perfringens é considerado um organismo de nível 2 de risco de biossegurança (BSL2). Embora nem todas as amostras de alimentos contenham C. perfringens, todas as amostras cultivadas devem ser tratadas como tal. Todas as precauções adequadas e equipamentos de proteção pessoal (EPI) devem ser usados o tempo todo. Descontamine todo o material antes do descarte.

1. Prepare RPM modificado (meio de perfringens rápido)

1. Combine 30 g/L de meio de tioglicolato fluido, 60 g/L de gelatina, 5 g/L de peptona, 5 g/L de glicose, 5 g/L de fosfato de potássio dibásico, 3 g/L de extrato de levedura, 1,5 g/L de cloreto de sódio, 0,5 g/L de sulfato ferroso em água deionizada até dispersar uniformemente. Normalmente fazemos lotes de 1 L.
2. Autoclave a 121 °C por 15 min.
3. Deixar arrefecer até cerca de 40 °C.
4. Quando o RPM estiver frio, adicione D-cicloserina a uma concentração final de 440 mg / L.
   NOTA: As concentrações de reserva de D-cicloserina dissolvida em água estéril a 50 mg/ml podem ser armazenadas a -20 °C para utilização futura.
5. Transfira assepticamente 10 mL de RPM para tubos cônicos de 15 mL. O RPM pode ser preparado em lotes e armazenado a 4 °C por até um mês.
6. Aqueça RPM a 37 °C antes de usar.

2. Coleta de amostras e incubação RPM

1. Transporte os alimentos para o laboratório em temperatura ambiente dentro de 1 h. Os alimentos podem ser transportados em embalagens originais ou recipientes estéreis. Se não forem testados imediatamente, os alimentos podem ser armazenados a -20 °C até serem utilizados. Se disponível, anote o tipo de alimento e o país de origem de acordo com o rótulo da embalagem, bem como qualquer outra informação relevante.
2. Remova aproximadamente 1,0–2,0 g de alimento e transfira para uma placa de Petri estéril ou equivalente. Pique finamente com uma lâmina de barbear ou bisturi estéril.
3. Inocular em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um tubo cônico de 15 mL. Misture bem.
   1. Para selecionar células vegetativas, transfira 5 mL da mistura PBS-alimento para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de RPM. Feche bem a tampa.
   2. Para selecionar os esporos, aqueça os 5 mL restantes da mistura PBS-alimento a 85 ° C por 15 min e depois transfira para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de RPM. Feche bem a tampa.
4. Vórtice e inverta as culturas de RPM de alimentos para garantir uma mistura completa.
5. Feche bem os tubos cônicos e embrulhe as tampas com filme de parafina ou filme plástico para garantir um ambiente anaeróbico.
6. Incubar durante a noite (ON) a 37 °C.
7. Na manhã seguinte, observe qualquer turbidez ou fermentação nos tubos RPM.

3. Revestimento "sanduíche" TSC (Tryptose Sulfito Cicloserina)

1. Inocular culturas ON RPM em ágar TSC utilizando uma técnica "sanduíche" (Figura 1) descrita abaixo.
2. Prepare o ágar TSC de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Prepare a camada de base das placas TSC transferindo 10 mL de ágar TSC fundido para placas de Petri estéreis e deixe solidificar. Estes podem ser preparados com antecedência e armazenados a 4 °C. Certifique-se de que as placas sejam aquecidas à temperatura ambiente antes de usar.
   2. Para a camada superior da placa TSC, manter o ágar TSC fundido restante a 40 °C.
      NOTA: Embora o ponto de fusão do ágar esteja acima de 85 ° C, o ágar fundido solidifica em torno de 32 a 45 ° C.
3. Recupere cuidadosamente as culturas ON RPM e transfira 100 μL para a base de ágar TSC. Por causa da fermentação, algumas culturas podem estar sob pressão. Certifique-se de usar todos os EPIs apropriados.
4. Espalhe o inóculo RPM usando esferas de vidro esterilizadas ou espalhador de células.
5. Deixe o RPM ser "absorvido" no ágar TSC por 5 a 10 minutos em temperatura ambiente.
6. Transfira cuidadosamente 20 ml de ágar TSC fundido a 40 °C para a placa utilizando uma pipeta serológica.
7. Recoloque a tampa da placa de Petri e deixe o ágar TSC solidificar completamente à temperatura ambiente.
8. Inverter a placa de Petri e incubar a 37 °C ON.
9. Se forem desejadas diluições em série, realize diluições das culturas ON RPM em RPM fresco e pré-aquecido antes da inoculação no ágar TSC.

4. Subcultura de colônias redutoras de sulfito

1. Na manhã seguinte, remova as placas da incubadora e examine o crescimento bacteriano. Bactérias aeróbicas podem estar presentes na superfície do ágar. Bactérias anaeróbicas serão encontradas crescendo embutidas no ágar. As bactérias redutoras de sulfito tornarão o ágar circundante preto. Possíveis colônias de C. perfringens serão pretas e embutidas no ágar.
2. As colônias suspeitas de C. perfringens serão positivas para redução de sulfito e aparecerão pretas, embutidas no ágar. Usando um conta-gotas estéril de uso único, "arranque" as colônias pretas do ágar e transfira para 10 mL de RPM fresco em um tubo cônico de 15 mL. É importante que o ar do conta-gotas seja expelido antes de perfurar o ágar.
3. Se houver uma quantidade densa de crescimento bacteriano aeróbico na superfície da placa, use um raspador de células estéreis para remover colônias de áreas selecionadas. Várias colônias suspeitas de C. perfringens podem ser amostradas da mesma placa TSC em culturas RPM separadas.
4. Prenda firmemente as tampas dos tubos cônicos e embrulhe em filme de parafina ou filme plástico. Incubar ON a 37 °C.

Resultados

Figura 1: Esquema da técnica de sanduíche de ágar TSC.

Os meios RPM contendo a bactéria C. perfringens são semeados entre duas camadas de ágar TSC para promover um ambiente anaeróbico.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
D-Cicloserina	Sigma-Aldrich	C6880
Dextrose	Sigma Ciências da Vida	D9434-250G
Pipetas de transferência descartáveis	qualquer marca		Selecione um com ponta fina como as pipetas de transferência descartáveis Thermo Scientific 137116M / EMD
Kits de Sangue e Tecidos DNeasy	Qiagen	69504	Nota: vários kits de extração de DNA e plasmídeo foram avaliados, este kit deu os resultados mais desejáveis.
Incubadora Seca	qualquer marca
Meio de tioglicolato fluido	Remel	R453452
Gelatina de pele suína	Sigma Ciências da Vida	G1890-500G
Sulfato de ferro (II) heptahidratado	Sigma Ciências da Vida	F8633-250 G
Lisozima de clara de ovo de galinha	Sigma-Aldrich	L6876	Necessário para extração de DNA, não fornecido no kit
Parafilme ou filme plástico	qualquer marca
Peptona de caseína e outras proteínas animais	Sigma-Aldrich	70173-100G
Base de ágar Perfringens (TSC + SFP)	Oxóide	CM0587	Faça ágar TSC de acordo com as instruções
Fosfato de potássio dibásico	Sigma-Aldrich	Pág. 2222-100G
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S-7653
Raspador de células estéreis	qualquer marca
Espalhador de células estéreis	qualquer marca
Placas de Petri estéreis	qualquer marca
Extrato de levedura	Sigma-Aldrich	70161-100G