Separação baseada em cromatografia em camada fina de nucleotídeos (p)ppGpp isolados de bactérias induzidas por estresse

Abstract

Fonte: Fernández-Coll, L. e Cashel, M. Usando radiomarcação de placa de microtitulação para múltiplas medições in vivo de Escherichia coli (p) ppGpp seguidas de cromatografia em camada fina. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo apresenta um protocolo de alto rendimento para medir os níveis e a dinâmica dos nucleotídeos bacterianos de resposta ao estresse ppGpp e pppGpp usando cromatografia em camada fina (TLC). O método fornece uma abordagem poderosa, rápida e econômica para quantificar (p)ppGpp em culturas bacterianas sob várias condições de estresse, permitindo a análise de alta resolução da fisiologia bacteriana e a resposta rigorosa.

Protocol

1. Cromatografia em camada fina
   1. Com um lápis macio, marque uma linha de origem a 1 cm da borda da placa de cromatografia em camada fina (TLC) de polietilenimina-celulose (PEI-celulose) de 20 cm x 20 cm que teve 5 cm removidos do topo com uma tesoura. Aplique 5 μL como gota na superfície PEI para cada amostra. Comece o desenvolvimento ascendente sem permitir que esse ponto seque, o que melhora a resolução minimizando as estrias.
   2. Faça o desenvolvimento ascendente em um tanque com uma camada de solução 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3,4) rasa o suficiente para que o líquido não toque no ponto da amostra de origem. Cub....

Results

Figura 1: Análise representativa da CPT. Representação esquemática dos resultados obtidos após autorradiografia e triagem de fósforo durante a noite com a CPT. Os pontos a serem medidos são mostrados em vermelho. A fórmula para calc.......

Materials