Separação baseada em cromatografia em camada fina de nucleotídeos (p)ppGpp isolados de bactérias induzidas por estresse

Abstract

Fonte: Fernández-Coll, L. e Cashel, M. Usando radiomarcação de placa de microtitulação para múltiplas medições in vivo de Escherichia coli (p) ppGpp seguidas de cromatografia em camada fina. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo apresenta um protocolo de alto rendimento para medir os níveis e a dinâmica dos nucleotídeos bacterianos de resposta ao estresse ppGpp e pppGpp usando cromatografia em camada fina (TLC). O método fornece uma abordagem poderosa, rápida e econômica para quantificar (p)ppGpp em culturas bacterianas sob várias condições de estresse, permitindo a análise de alta resolução da fisiologia bacteriana e a resposta rigorosa.

Protocol

1. Cromatografia em camada fina
   1. Com um lápis macio, marque uma linha de origem a 1 cm da borda da placa de cromatografia em camada fina (TLC) de polietilenimina-celulose (PEI-celulose) de 20 cm x 20 cm que teve 5 cm removidos do topo com uma tesoura. Aplique 5 μL como gota na superfície PEI para cada amostra. Comece o desenvolvimento ascendente sem permitir que esse ponto seque, o que melhora a resolução minimizando as estrias.
   2. Faça o desenvolvimento ascendente em um tanque com uma camada de solução 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3,4) rasa o suficiente para que o líquido não toque no ponto da amostra de origem. Cubra o tanque com uma vedação hermética e deixe o líquido subir até o topo da folha aparada, 15 cm. Para atingir o pH 3,4 para uma solução 1,5 M KH₂PO₄ , é necessário ajustar o pH adicionando H₃PO₄.
   3. Remover o cromatograma totalmente desenvolvido e secar ao ar à temperatura ambiente.
   4. Cortar e rejeitar a parte superior (pH frontal) do cromatograma que contém o ³²P livre em resíduos radioactivos. Esta porção é representada na cor amarela na Figura 1 e é facilmente visualizada sob luz ultravioleta. Se medir apenas nucleotídeos (p)ppGpp que migram mais lentamente que o trifosfato de guanosina (GTP), recomenda-se executar um padrão GTP UV-visível e, em seguida, cortar e descartar uma porção superior maior (qualquer coisa acima do GTP, conforme mostrado na Figura 1).
   5. Exponha filmes auto-radiográficos durante a noite com uma tela de fósforo.
   6. Revele o filme. Capture e quantifique o sinal da tela de fósforo com um fosfoimager.
       
2. Quantificação de (p)ppGpp
   1. Quantifique os pontos radioativos com a Imagem J.
      NOTA: A quantidade de (p)ppGpp pode ser normalizada para a quantidade total de nucleotídeos G observada em cada amostra (Figura 1). Se a quantidade de fundo for homogênea, um único espaço em branco (caixa 4 da Figura 1) pode ser subtraído para corrigir o fundo. G total é a soma de GTP + ppGpp + pppGpp detectado. Essa normalização pressupõe que os níveis de monofosfato de guanosina (GMP) e difosfato de guanosina (GDP) são insignificantes, o que é verdade para Escherichia coli. A proporção de um determinado nucleotídeo para G total fornece uma maneira importante de corrigir variações no volume da amostra aplicada.

Results

Figura 1: Análise representativa da CPT. Representação esquemática dos resultados obtidos após autorradiografia e triagem de fósforo durante a noite com a CPT. Os pontos a serem medidos são mostrados em vermelho. A fórmula para calc...

Materials