Cultura de células únicas de bactérias em vesículas gigantes

Neste artigo

Resumo

Fonte: Morita, M., et al. Cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra um método para cultivar e observar células bacterianas individuais encapsuladas dentro de vesículas gigantes ancoradas a uma bicamada lipídica suportada. O sistema permite imagens estáveis e de longo prazo da dinâmica de crescimento de uma única célula em um microambiente confinado e fisiologicamente relevante.

Protocolo

1. Preparação de um Sistema de Observação de Vesícula Gigante (GV) (Sistema de Cultura de Células Bacterianas)

Preparação de pequenas vesículas (SVs) para a construção de uma membrana de bicamada suportada
1. Despeje 20 μL da solução de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) e 4 μL da solução de biotina-PEG-DSPE (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[biotinil(polietilenoglicol)-2000) em um tubo de vidro.
2. Evaporar o solvente orgânico por fluxo de ar para formar uma película lipídica e colocar esta amostra num exsicador durante 1 h para evaporar completamente o solvente orgânico.
3. Adicione 200 μL de glicose 200 mM em meio 1x LB (caldo Luria-Bertani) (a solução aquosa externa de GVs) ao frasco de vidro.
4. Envolva a parte inicial do frasco de vidro com filme e sonice em um banho ultrassônico (120 W) por pelo menos 1 h.
5. Preparar SVs pelo método de extrusão utilizando uma miniextrusora e uma membrana de policarbonato com poros de 100 nm.
Preparação de uma câmara artesanal
1. Faça um furo de 7 mm com um punção oco em uma vedação de dupla face (10 mm x 10 mm x 1 mm).
2. Cole a vedação dupla face com o orifício em uma lamínula (30 mm x 40 mm, espessura 0.25–0.35 mm).
Preparação de uma membrana de bicamada suportada na lamínula no orifício da câmara
1. Adicionar 30 μL da solução SV ao orifício da câmara (preparado na secção 2.2) e incubar em RT durante 30 min.
2. Lave suavemente o orifício duas vezes com 20 μL de meio 1x LB contendo 200 mM de glicose (a solução aquosa externa de GVs) por pipetagem.
Imobilização de GVs na membrana de bicamada suportada na lamínula no orifício da câmara
1. Introduzir 10 μL de neutravidina com a solução aquosa externa de GVs (1 mg/mL) no orifício e incubar em RT por 15 min.
2. Lave suavemente o orifício duas vezes com 20 μL de meio 1x LB contendo 200 mM de glicose (a solução aquosa externa de GVs) por pipetagem.
3. Adicione toda a solução contendo GVs no orifício da câmara e sele com uma lamínula (18 mm x 18 mm, espessura 0,13–0,17 mm) (Figura 1b).
Observação microscópica do crescimento celular bacteriano dentro de GVs
1. Defina um sistema de estágio de aquecimento microscópico com um microscópio invertido equipado com uma lente objetiva de abertura numérica (NA) de 40x/0.6 com uma longa distância de trabalho (Figura 1b).
2. Coloque a câmara no aquecimento microscópico stage sistema (Figura 1b). Incubar os GVs contendo células bacterianas na câmara em condições estáticas durante 6 h a 37 °C.
3. Capture e registre imagens de microscópio do crescimento de células bacterianas dentro de GVs a cada 30 minutos usando uma câmera científica de semicondutores de óxido metálico complementar (sCMOS).

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Resultados

Figura 1: O sistema de observação da cultura de células bacterianas dentro de GVs. (a) Os GVs são imobilizados em uma membrana suportada por meio da ligação biotina-neutravidina na lamínula. Os GVs são incubados por um siste...