Investigando a resposta bacteriana ao etileno usando um composto liberador de etileno

Neste artigo

Resumo

Fonte: Augimeri, R. V. et. al., Utilizando o composto liberador de etileno, ácido 2-cloroetilfosfônico, como uma ferramenta para estudar a resposta do etileno em bactérias. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o efeito do etileno gerado pelo ácido 2-cloroetilfosfônico (CEPA) no crescimento bacteriano e na produção de celulose. O etileno ativa vias de sinalização que estimulam a síntese de celulose, resultando em maior formação de películas. Esses resultados destacam a resposta bacteriana ao etileno.

Protocolo

Ensaios de película
1. Cultive e quantifique culturas iniciais de Komagataeibacter xylinus em triplicado:
  1. Em triplicata, inocular uma única colônia de Komagataeibacter xylinus em 5 ml de meio Schramm e Hestrin (SH) (pH 5) suplementado com 0,2% (v/v) de celulase esterilizada por filtro. Incubar culturas a 30 °C com agitação a 150 rpm até atingir uma densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de 0,3 a 0,4 (cerca de 72 horas).
  2. Colheita de culturas iniciais por centrifugação (2.000 x g; 4 °C; 10 min). Lave as células duas vezes com 5 ml de solução salina estéril e ressuspenda o pellet celular. Mantenha as células no gelo.
  3. Quantifique as células usando uma câmara de contagem de Petroff-Hausser.
2. Prepare misturas mestras para inocular placas de 24 poços:
  1. Suplemente 60 ml de meio SH (pH 7) com 120 μl dos estoques de ácido 2-cloroetilfosfônico (CEPA) de 5, 50 e 500 mM para obter concentrações finais de CEPA de 0,01, 0,1 e 1,0 mM, respectivamente. Completar mais 60 ml de meio SH (pH 7) com 120 μl do solvente utilizado para dissolver o CEPA. Vórtice para misturar.
  2. Dividir cada 60 ml de meio contendo CEPA em quatro alíquotas de 14 ml. Inocular três das alíquotas de 14 ml com réplicas biológicas da cultura inicial a uma concentração de 10⁵ células/ml. Mantenha os tubos com células no gelo para evitar a produção de celulose.
    NOTA: A alíquota de 14 ml restante será usada para alvéolos de controle estéreis.
3. Inocular placas de 24 poços:
  1. Testar cada tratamento na sua própria placa, com três filas de réplicas biológicas e uma fileira de controlos estéreis (figura 1).
  2. Usando a mistura principal de 14 ml, adicione 2 ml em cada um dos seis alvéolos de uma placa estéril de 24 poços. Completo para os três replicados biológicos e controle estéril (Figura 1). Repita para cada tratamento.
  3. Selar as placas com película de parafina e incubar estaticamente durante 7 dias a 30 °C.
  4. Colha e meça o peso seco da película (rendimento de celulose) (Figura 1):
    1. Transfira individualmente as películas para os poços de uma placa de 6 poços. Para lisar as células, trate as películas com 12 ml de hidróxido de sódio (NaOH) 0,1 N a 80 °C por 20 min.
    2. Remova o NaOH e neutralize as películas lavando com água ultrapura por 24 horas com agitação. Troque a água a cada 6 horas.
      NOTA: As películas devem ser brancas após a conclusão da etapa de lavagem.
    3. Coloque os pesos da película em tapetes de silicone e seque a 50 °C por 48 horas até peso constante. Depois de secos, remova-os das esteiras e meça seus pesos em uma balança analítica para determinar o rendimento de celulose bacteriana.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Figura 1: Fluxograma ilustrando o protocolo utilizado para o ensaio e análise da película. O meio estoque de pH 7 SH suplementado com CEPA (60 ml) é aliquotado para três inoculações biológicas replicadas separadas e um controle estéril (14 ml cada). Essas culturas são ent...