Amplificação de um plasmídeo suicida em um hospedeiro bacteriano

Resumo

Fonte: Tomás, J. M., et al. Geração de mutantes nulos para elucidar o papel das glicosiltransferases bacterianas na motilidade bacteriana. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra a amplificação dependente do iniciador de um plasmídeo suicida em E. coli. O plasmídeo, que carrega um gene de resistência a antibióticos, se replica apenas na presença de uma proteína iniciadora codificada pelo hospedeiro. Após eletroporação e incubação em meio de recuperação, a mistura é semeada em ágar contendo antibióticos. As bactérias com um plasmídeo sobrevivem, pois sua proteína iniciadora permite a expressão do gene resistente a antibióticos do plasmídeo.

Protocolo

1. Geração de mutantes nulos nos genes da ilha de glicosilação de flagelos

NOTA: Este método de mutagênese é baseado na troca alélica de produtos de deleção em quadro da reação em cadeia da polimerase (PCR) usando o vetor suicida pDM428 (GenBank: KC795686.1). A replicação do vetor pDM4 é dependente do lambda pir , e a troca alélica completa é coagida pela utilização do gene sacB localizado no vetor.

1. Construção de produtos de deleção PCR in-frame.
   1. Projete dois pares de primers que amplificam as regiões de DNA a montante (primers A e B) e a jusante (primers C e D) do gene ou região selecionada a ser excluída (Figura 1B).
   2. Certifique-se de que os primers A e D tenham mais de 600 pb a montante desde o início e a jusante da parada, respectivamente, do gene ou genes a serem excluídos. Esses dois primers precisam incluir um local de restrição na extremidade 5 'para uma endonuclease que permita a clonagem em pDM4.
      NOTA: O local de restrição incluído na extremidade 5' dos primers A e D não deve ser o mesmo que os locais dentro dos amplicons AB ou CD.
   3. Certifique-se de que os Primers B e C estejam dentro do gene a ser excluído ou dentro do primeiro e último gene, respectivamente, da região a ser excluída. Certifique-se de que ambos os primers (B e C) estejam no quadro e localizados entre 5-6 códons dentro do gene. Além disso, certifique-se de que ambos os primers incluam na extremidade 5 'uma sequência complementar de 21 pb (Tabela 1) que permita unir os amplicons de DNA AB e CD.
   4. Cultive a cepa selecionada de Aeromonas em 5 mL de caldo de soja tríptico (TSB) durante a noite (O/N) a 30 °C. Use um kit disponível comercialmente para purificação de DNA genômico e siga as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Quantificar 2 μL do ADN purificado utilizando um espectrofotómetro.
      NOTA: Use água bidestilada como branco, com o instrumento configurado para registrar a absorbância a 260 nm. Registre a absorbância com 2 μL de DNA purificado 3-5 vezes e calcule uma leitura média de absorbância. Use a lei de Beer-Lambert para calcular a concentração de DNA, onde A = Ɛ.c.l. Em que "A" é a absorbância, "Ɛ" é o coeficiente de extinção médio molar para o DNA, "c" é a concentração de DNA e "l" é o comprimento do caminho (consulte as instruções do fabricante para o comprimento do caminho de cada instrumento).
   5. Use 100 ng de DNA cromossômico purificado como molde em dois conjuntos de PCRs assimétricos com primers AB e CD (Tabela de Materiais). Use uma proporção molar de 10:1 de pares de primers A:B e D:C.
      NOTA: As PCRs assimétricas permitem a amplificação preferencial de uma fita do molde sobre a outra.
   6. Analise os produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose a 1%. Use TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)) como tampão de execução de gel e uma configuração de potência de 8 V / cm. Para visualizar o DNA, adicione brometo de etídio (0,5 μg/mL) ao gel e visualize os produtos de PCR usando uma estação de bioimagem (Tabela de Materiais).
   7. Extirpar os amplicons do gel com bisturi, purificá-los seguindo o protocolo do fabricante (Tabela de Materiais) e quantificá-los.
   8. Junte os amplicons AB e CD por suas sequências sobrepostas de 21 pb na extremidade 3 'dos produtos de PCR (Figura 2). Misture 100 ng de cada amplicon (AB e CD) em um tubo de PCR com reagentes de PCR (PCR pré-AD), mas sem primers, e estenda usando o programa termociclador. Em seguida, adicione 100 μM de primers A e D à reação (AD PCR) e amplifique como um único fragmento.
   9. Analise o produto de PCR (amplicon AD) por eletroforese em um gel de agarose a 1% usando as condições descritas na etapa 1.1.6, excise o amplicon do gel, purifique-o seguindo o protocolo do fabricante e quantifique o amplicon (Tabela de Materiais).
2. Construção do plasmídeo recombinante pDM4 com a deleção no quadro.
   1. Cultive uma cultura O/N de Escherichia coli cc18λ pir contendo pDM4 em caldo Luria-Bertani (LB) Miller (10 mL) com cloranfenicol (25 μg/mL) a 30 °C.
   2. Centrifugar a cultura a 5.000 x g a 4 °C e suspender o pellet em 600 μL de água destilada estéril. Realize a extração e purificação do plasmídeo pDM4 usando um kit de purificação de plasmídeo disponível comercialmente, seguindo as instruções do provedor (Tabela de Materiais).
   3. Digerir 1 μg de pDM4 e 400 ng de amplicon AD por 2 h com uma endonuclease capaz de digerir ambas as extremidades do amplicon AD e o local de clonagem de pDM4 (Figura 2). Siga o protocolo do fabricante da enzima para as condições de reação (Tabela de Materiais).
   4. Limpe o plasmídeo digerido e o amplicon usando um kit de purificação de DNA e quantifique-os seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais).
   5. Para evitar a religação do pDM4 linearizado, remova o grupo fosfato de ambas as extremidades 5' usando a enzima fosfatase alcalina seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Em seguida, limpar o plasmídeo tratado e quantificá-lo utilizando um espectrofotómetro, conforme descrito no passo 1.1.4 (Tabela de materiais).
   6. Combine 150 ng do pDM4 digerido e tratado com fosfatase alcalina com 95-100 ng de amplicon AD digerido em uma proporção molar vetor: inserção de 1: 4. Preparar a reação de ligadura em um volume de 15 μL, seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais).
   7. Incubar O/N a 20 °C ou ao fim de semana a 4 °C. Após a incubação, inative a ligase T4 a 70 °C por 20 min.
   8. Use a ligação para introduzir o plasmídeo na cepaλpir de Escherichia coli MC1061 por eletroporação. Use bactérias eletrocompetentes e cubetas de eletroporação com intervalo de 2 mm.
3. Preparação de E. coli eletrocompetente e eletroporação de plasmídeo recombinante pDM4
   1. Inocular uma única colónia de estirpe de E. coli MC1061λpir em caldo Luria-Bertani (LB) Miller e cultivar O/N a 30 °C com agitação de 200 rpm.
   2. Diluir 2 mL da cultura bacteriana em 18 mL de caldo LB e incubar a 30 ° C com agitação (200 rpm) até atingir uma densidade óptica (OD600) entre 0,4-0,6.
   3. Pulverize a cultura bacteriana por centrifugação a 5.000 x g e 4 °C por 15 min. Rejeitar o sobrenadante e suspender o pellet em 40 ml de H₂O destilado refrigerado.
   4. Repita esta etapa de limpeza mais duas vezes para remover todos os sais de cultura. Finalmente, suspenda o pellet em 4 mL de H₂O destilado resfriado e transfira 1 mL da suspensão para cada um dos quatro tubos cônicos de 1,5 mL.
   5. Pulverize a cultura bacteriana por centrifugação a 14.000 x g e 4 °C por 5 min. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e suspender cada sedimento em 100 μL de H₂O destilado refrigerado.
   6. Adicione 3-3,5 μL da mistura de ligadura a cada tubo e incube no gelo por 5 min. Em seguida, transfira o conteúdo de cada tubo para uma cubeta de eletroporação gelada com intervalo de 2 mm e aplique 2 kV, 129 Ω e uma constante de tempo de cerca de 5 ms.
      NOTA: Pré-resfrie as cubetas de eletroporação em gelo. Mantenha as bactérias no gelo durante todo o procedimento.
   7. Após a eletroporação, adicione 250 μL de meio SOC (caldo Super Optimal com repressão catabólica) a cada uma das quatro cubetas para recuperar seu conteúdo, transfira-as para um tubo de cultura (cerca de 1 mL) e incube por 1 h a 30 ° C com agitação (200 rpm).
   8. Coloque as células transformadas em placas de ágar Luria-Bertani (LB) suplementadas com cloranfenicol (25 μg/mL) para garantir que todas as colônias que crescem na placa tenham a estrutura do plasmídeo.

Tabela 1: Primers usados para a construção de mutantes nulos. As regiões sobrepostas nos primers B e C são sublinhadas. O site BamHI está em negrito nos primers A e D.

Nome do primer	Sequência na direção de 5 'a 3'	Usado para
A. piscicola AH-3
A-FLGI1	CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA	Mutante FGI
B-FLGI1	CCCATCCACTAAACTTAAACAGATCACCTCGAACTCGAAA
C-FLGI12	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGGAACCTTAAATGCCATGA
D-FLGI12	CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
E-FLGI1	ACCCGCTTCATTCGCTAT
F-FLGI12	TCCGATTTTCTGACTCAGGG
A-Fgi4	CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA	Mutante FGI-4
B-FGI4	CCCATCCACTAAACTTAAACACATATTATCTTGCCCCTGAT
C-Fgi4	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGATGGAGCTAATCACTCGTTT
D-FGI4	CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC
E-FGI4	ATTTCCCTGCCAAATACG
F-FGI4	CCTGCCAACAGGATGTAAG
vetor pDM4
pDM4para	AGTGATCTTCCGTCACAGG	Inserções no vetor pDM4
pDM4rev	AAGGTTTAACGG TTGTGGA

Resultados

Figura 1: Detecção bioinformática de regiões cromossômicas e design de primer. (A) Esquema de regiões cromossômicas identificadas em A. hydrophila AH-1 e A. piscicola AH-3. A ilha de glicosilação de flagelos AH-1 de A. hydrophila é represent...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Kit de Reação Pronta para Sequenciamento de Ciclo	Biossistemas Aplicados	4337455	Usado para sequenciamento
AccuPrime Taq DNA Polimerase, alta fidelidade	Invitrogen	12346-086	Usado para amplificação de fragmentos AB, CD e AD
Agarose	Conda-Pronadise	8008	Usado para eletroforese de DNA
Fosfatase alcalina intestinal de vitelo (CIAP)	Promega	M1821	Usado para remover o fosfato na extremidade 5'
Ágar-bacto	Becton Dickinson	214010	Use para análise de motilidade
BamHI	Promega	R6021	Usado para restrição de endonuclease
BglII	Promega	R6081	Usado para restrição de endonuclease
Sistema BioDoc-It Imagin	UVP		Estação de bioimagem usada para visualização de DNA
Biotaq polimerase	Biolinha	BIO-21040	Usado para triagem de colônias
Kit de Purificação de Banda de Gel e DNA de PCR de GCixa Cytiva illustra	Cytivia	28-9034-71	Usado para purificação de amplicons de PCR e fragmentos de DNA.
EDTA	Aplicativo	131026.1211	Usado para eletroforese de DNA
Cubetas de eletroporação com folga de 2 mm	VWR	732-1133	Usado para transformação
Ágar Luria-Bertani (LB) Miller	Condalab	996	Usado para cultura de Escherichia coli
Caldo Luria-Bertani (LB) Miller	Condalab	1551	Usado para cultura de Escherichia coli
Nanodrop ND-1000	NanoDrop Techonologies Inc		Espectrofotômetro usado para quantificação de DNA
Rifampicin	Aplicativo	A2220,0005	Usado para acasalamento triparental
SOC Médio	Invitrogen	15544034	Usado para recuperação de eletroporação
DNA ligase T4	Invitrogen	15224017	Usado para reação de ligadura
Termociclador Veriti de 96 poços	Biossistemas Aplicados		Usado para reações de PCR