Isolamento de bactérias Gram-negativas com inserções de transposons genômicos

Neste artigo

Resumo

Fonte: Kazi, M. I., et. al., Gerando bibliotecas de inserção de transposons em bactérias Gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento. J. Vis. (2020)

Este vídeo demonstra a seleção, quantificação e preservação de bactérias receptoras Gram-negativas portadoras de inserções de transposons com base na resistência à canamicina.

Protocolo

Geração da biblioteca mutante bacteriana final

Descongele uma alíquota do acasalamento congelado no gelo.
Acasalamento em placas de ágar Luria-Bertani (LB) de 150 mm suplementadas com canamicina com base em unidades formadoras de colônias (UFC) calculadas na etapa 3.1. Ajuste o volume com LB para produzir 13.333 colônias por 150 μL antes do revestimento.
NOTA: A contagem de UFC aqui foi determinada em cerca de 10⁵ UFC / mL, então o volume de acasalamento foi ajustado para obter 13.333 colônias por placa. Isso forneceria um número ideal de colônias em 30 placas para uma biblioteca mutante de alta resolução sem superlotar as placas.
Use esferas de vidro estéreis para espalhar 150 μL da diluição por placa em placas de ágar Luria-Bertani de 30 x 150 mm suplementadas com canamicina para obter 400.000 colônias (Figura 1C).
NOTA: Hastes estéreis ou qualquer tipo de ferramenta espalhadora estéril (ou seja, contas de vidro) podem ser usadas para espalhar as bactérias nas placas.
Descarte o tubo usado que contém o excesso de acoplamento.
NOTA: Os ciclos de congelamento / descongelamento adicionam pressões seletivas na cultura bacteriana, o que pode distorcer os resultados do experimento Tn-seq. Use uma alíquota nova a cada vez.
Incubar as placas a 37 °C durante 14 h.
NOTA: O tempo de incubação é otimizado para evitar o crescimento excessivo (toque das colônias). Sugere-se minimizar o crescimento reduzindo o tempo de incubação.

Estimando a densidade da biblioteca e o pool para armazenamento

Conte as UFCs em cada placa para estimar o total de mutantes na biblioteca de transposons. Conte 20% de pelo menos 3 placas para determinar a estimativa da contagem de colônias para todo o grupo de placas (Figura 2A). Certifique-se de que as colônias não estejam tocando em outra colônia.
Depois de calcular o rendimento estimado da colônia, adicione 3-5 mL de LB (ou mais, se necessário) a cada placa e raspe as bactérias usando uma ferramenta de raspagem estéril. NOTA: Alças de inoculação estéreis foram usadas para raspar as placas com eficiência.
Agrupe as suspensões bacterianas de todas as placas em tubos cônicos de 50 mL (Figura 1D). Isso exigirá vários tubos cônicos de 50 mL, pelo menos 3.
Suspensão bacteriana agrupada em pellets usando centrifugação a 5.000 x g por 7 min.
Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5 mL de LB suplementado com glicerol a 30%.
Alíquota de 1 mL da biblioteca de transposons em criogeniais e armazenar a -80 °C.

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Resultados

Figura 1: Esquema da construção da biblioteca mutante do transposon. (A) Conjugação bacteriana. A cepa "doadora", que codifica a maquinaria de transposição, foi misturada com a cepa "receptora". A mistura foi manchada em placas de ágar Luria-Be...