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1. Transformação Natural
NOTA: O derivado N315, N2-2.1 foi usado como receptor. Nessa linhagem, o locus sigH foi duplicado de modo a expressar constitutivamente o SigH. Se o marcador de resistência a ser transferido não for cloranfenicol, pRIT-sigH (CmR) pode ser usado para expressar SigH. O plasmídeo purificado ou o extrato de DNA completo de S. aureus COL-45 adquirido por cfr é usado como DNA do doador para transformação.
- Preparação do DNA do doador
- Cultive COL-45 durante a noite com agitação a 37 ° C em um frasco de 300 ml contendo 50 mL de caldo de soja tríptico (TSB) suplementado com 32 mg / L de cloranfenicol. Cultura de E. coli HST04 portadora do plasmídeo pHY300 (TetR) para extrair o plasmídeo para o experimento de controle.
NOTA: HST04 (dam-/dcm-) não possui os genes da DNA metilase. Outras cepas convencionais com DNA metilases também podem ser usadas para preparar o doador de DNA, porque o estado de metilação do DNA não afeta a eficiência da transformação. Alternativamente, o plasmídeo pT181 purificado da cepa S. aureus COL também pode ser usado como um controle positivo para o ensaio de transformação. - Colete as células por centrifugação (8.000 x g por 10 min a 4 ° C).
- Extraia os plasmídeos usando um kit de extração de DNA de plasmídeo ou um método convencional de purificação de DNA para purificar todo o DNA.
- Quantificar o ADN purificado por espectrómetro e mantê-lo a 4 °C até à utilização.
NOTA: Use uma preparação de DNA fresca para o ensaio de transformação, geralmente com menos de uma semana de idade. Preparações antigas de DNA reduzem a eficiência da transformação.
- Ensaio de transformação
- Cultivar a célula receptora (N2-2.1) durante a noite em 5 ml de TSB a 37 °C com agitação.
- Transfira 0,5 ml da cultura durante a noite para um tubo de 1,5 ml. Precipitar as células por centrifugação (10.000 x g durante 1 min a 4 °C).
- Suspenda as células com 10 ml de meio CS2 num tubo de 50 ml.
NOTA: O meio CS2 é um meio sintético completo que induz competência para a transformação natural em S. aureus. Outros meios laboratoriais padrão, como TSB ou infusão de coração cerebral (BHI), não são adequados para transformação. - Cultive a bactéria a 37 ° C com agitação (180 rpm) até a fase exponencial tardia (cerca de 8 horas).
- Colha as células por centrifugação (5.000 x g por 5 min a 4 ° C).
- Ressuspender as células em 10 ml de meio CS2 fresco.
- Adicionar 10 μg de plasmídeo purificado ou de ADN do genoma (passo 1.1.4) à suspensão celular. Agite a 37 °C e 180 rpm por 2,5 horas.
NOTA: Tempos de incubação mais curtos com DNA (<2,5 horas) resultam em frequências de transformação mais baixas. - Coletar células por centrifugação (5.000 x g por 5 min a 4 °C).
- Ressuspenda as células em 10 mL de meio BHI. Misturar a suspensão celular com 90 ml de suplemento de ágar BHI derretido (55 °C) com 32 mg/L de cloranfenicol (ou 5 mg/L de tetraciclina na experiência de controlo). Despeje a mistura nas placas de Petri de 90 mm. Deixe esfriar rapidamente e deixe o ágar solidificar.
- Incubar as placas a 37 °C durante 2 dias.
- Replique as colônias geradas (transformantes) transferindo as colônias (usando palitos de dente) para novas placas de ágar BHI contendo os antibióticos apropriados para confirmar suas características de resistência. Confirmar o gene de resistência adquirida (cfr ou tetM) por PCR de colónias.