Avaliação da mortalidade induzida por bactérias patogênicas em larvas de C. elegans

Resumo

Fonte: Anderson, Q. L., et al. Um patossistema de C. elegans de alto rendimento, alto conteúdo e base líquida. J. Vis. Exp. (2018)

O vídeo demonstra um ensaio em base líquida onde larvas de C. elegans geneticamente modificadas são expostas a bactérias patogênicas em uma microplaca. As toxinas bacterianas secretadas no meio induzem o estresse e a morte do hospedeiro. Um corante fluorescente cora vermes mortos, permitindo a quantificação baseada em imagens da mortalidade para avaliar a suscetibilidade ou resistência genética.

Protocolo

1. Configuração do ensaio de morte líquida (protocolo básico)

Nota: Este é um protocolo para uma cepa bacteriana e uma fonte de vermes.

1. Usando um raspador de células, remova a Pseudomonas aeruginosa de uma placa Slow Killing ou SK e ressuspenda em ~ 5 mL de S Basal. Aumente a escala se necessário. Medir a densidade óptica da suspensão bacteriana com um espectrofotómetro (OD₆₀₀)
2. Preparar 24 ml de massa diluída de P. aeruginosa em S basal a₆₀₀ ≈ 0,09 (concentração final 3X). Consulte 4.6.2 para o conteúdo final por poço e dimensione o volume da diluição bacteriana de acordo.
3. Adicione 21 mL de meio líquido Slow Kill (3 g de NaCl, 3,5 g de peptona/L suplementado com CaCl₂ e MgSO₄ até uma concentração final de 1 mM). Usando uma pipeta multicanal, transfira 45 μL de bactérias e meios para cada poço de uma placa de 384 poços.
4. Lave os vermes de sua fonte em um tubo cônico de 50 mL e permita que os vermes se instalem sob a força gravitacional. Aspirar sobrenadante a 5 ml. Ressuspender em um total de 50 mL de S basal.
5. Repita a etapa 1.4 duas vezes.
6. Usando um classificador de minhocas, classifique aproximadamente 22 minhocas em cada poço da placa de 384 poços.
   Nota: A configuração descarta cada verme em ~ 1,1 μL de líquido. 22 vermes totalizarão 25 μL, elevando o volume total do ensaio para 70 μL / poço.
   1. A composição final de cada poço consiste em 70 μL. 45 μL deste volume são adicionados como meio bacteriano (0,03 OD₆₀₀ bactérias em 24 μL S Basal e 21 μL SK suplementado com CaCl₂ e MgSO₄). Os outros 25 μL são adicionados com os 22 vermes.
   2. Se o classificador usado aqui (consulte a Tabela de Materiais) não estiver disponível, os vermes podem ser diluídos até uma concentração final de 1 verme/μL em S Basal e pipetados 25 μL/poço usando uma pipeta multicanal. No entanto, os resultados podem apresentar maior variabilidade. Alternativamente, é possível usar um dispensador de líquido peristáltico, conforme descrito por Leung e colegas.
7. Depois que os vermes forem classificados na placa de 384 poços, sele a placa com um filme permeável a gás e incube as placas a 25 °C por 24 a 48 h.
8. No momento desejado, use uma lavadora de microplacas para lavar a placa de 384 poços com S Basal um total de 5 vezes.
   1. Após a segunda lavagem, aspire a maior parte do meio, deixando ~ 20 μL. Agite vigorosamente as placas usando um vórtice de microplacas por pelo menos 30 segundos para soltar quaisquer detritos do fundo dos poços).
9. Após a lavagem final, aspire o sobrenadante até 20 μL. Adicione 50 μL de corante de ácido nucleico 0,98 μM (consulte a Tabela de Materiais)/poço da placa de 384 poços, para uma concentração final de 0,7 μM.
10. Incubar à temperatura ambiente durante 12 - 16 h. Este corante só mancha vermes mortos. Após o período de incubação desejado, lave as placas usando o lavador de microplacas para remover qualquer excesso de mancha (mínimo de 3 lavagens).
11. Para aquisição de dados, use um espectrofotômetro ou um microscópio automatizado para obter imagens da luz transmitida e da fluorescência (excitação de 531 nm e emissão de 593 nm).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
COPAS FP BioSorter	União Biométrica		Citômetro de fluxo de objetos grandes/classificador de vermes
Citação 5	BioTek
Dispensador de lavadora EL406	BioTek
Multitron Pro	Jogadores de Inteligência HT
24 Bloco RB de poço profundo	Thermo Fisher Científico	CS15124
Placa de 384 poços	Greiner Bio-One	MPG-781091
Meios de crescimento de nematóides (NGM)			Quantidade por litro: 18 gramas de ágar, 3 gramas de NaCl, 2,5 gramas de peptona, 1 mL de CaCl₂ (1 M), 1 mL de MgSO₄ (1 M), 25 mL de tampão fosfato e 973 mL de água mili-Q
Placas de eliminação lenta (SK)			Quantidade por litro: 18 gramas de ágar, 3 gramas de NaCl, 3,5 gramas de peptona, 1 mL de CaCl₂ (1 M), 1 mL de MgSO₄ (1 M), 25 mL de tampão fosfato e 973 mL de água mili-Q
Mídia de Slow Killing (SK)			Quantidade por litro: 3 gramas de NaCl, 3,5 gramas de peptona, 1 mL de CaCl₂ (1 M), 1 mL de MgSO₄ (1 M), 25 mL de tampão fosfato e 973 mL de água mili-Q
Caldo de Lisogenia (LB)	Ciências da Vida Radiológicas	L1520
Caldo de infusão de coração Brian (BHI)	Produtos de Pesquisa International Corp	50-488-526
Solução de alvejante de minhoca			Quantidade por 100 mL: 10 mL de solução de NaOH 5 M, 20 mL de solução de hipoclorito de sódio a 5% e 70 mL de água estéril
S Basal			Quantidade por litro: 5,85 gramas de NaCl, 6 gramas de KH₂PO₄, 1 grama de K₂HPO₄ e 1 litro de água mili-Q
Ágar	Ciências da Vida Radiológicas	A0930
NaCl	Ciências da Vida Radiológicas	S5000
Peptona	Ciências da Vida Radiológicas	Pág. 3300
CaCl₂	Ciências da Vida Radiológicas
MgSO₄	Fisher Científico	M63-500
Tampão fosfato			quantidade por litro: 132 mL de K₂HPO₄ (1M) e 868 mL de KH₂PO₄ (1M)
KH₂PO₄	Acros Orgânicos	7778-77-0
K₂HPO₄	Ciências da Vida Radiológicas	Pág. 5100
Solução de hipoclorito de sódio a 5%	BICCA	7495.5-32
Solução de NaOH	Fisher Científico	SS255-1
Respire com facilidade	Biotecnologia diversificada	BEM-1
Mancha de ácido nucleico laranja SYTOX	Fisher Científico	S11368
Cepas bacterianas
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis (OG1RF)
Superalimento de E. coli (OP50)
E. coli Bactérias que expressam RNAi (HT115)
Cepas de vermes
glp-4 (bn2) (Beanan e Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::Repórter GFP (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)