Avaliação da mortalidade induzida por bactérias patogênicas em larvas de C. elegans

Resumo

Fonte: Anderson, Q. L., et al. Um patossistema de C. elegans de alto rendimento, alto conteúdo e base líquida. J. Vis. Exp. (2018)

O vídeo demonstra um ensaio em base líquida onde larvas de C. elegans geneticamente modificadas são expostas a bactérias patogênicas em uma microplaca. As toxinas bacterianas secretadas no meio induzem o estresse e a morte do hospedeiro. Um corante fluorescente cora vermes mortos, permitindo a quantificação baseada em imagens da mortalidade para avaliar a suscetibilidade ou resistência genética.

Protocolo

1. Configuração do ensaio de morte líquida (protocolo básico)

Nota: Este é um protocolo para uma cepa bacteriana e uma fonte de vermes.

1. Usando um raspador de células, remova a Pseudomonas aeruginosa de uma placa Slow Killing ou SK e ressuspenda em ~ 5 mL de S Basal. Aumente a escala se necessário. Medir a densidade óptica da suspensão bacteriana com um espectrofotómetro (OD₆₀₀)
2. Preparar 24 ml de massa diluída de P. aeruginosa em S basal a₆₀₀ ≈ 0,09 (concentração final 3X). Consulte 4.6.2 para o conteúdo final por poço e dimensione o volume da diluição bacteriana de acordo.
3. Adicione 21 mL de meio líquido Slow Kill (3 g de NaCl, 3,5 g de peptona/L suplementado com CaCl₂ e MgSO₄ até uma concentração final de 1 mM). Usando uma pipeta multicanal, transfira 45 μL de bactérias e meios para cada poço de uma placa de 384 poços.
4. Lave os vermes de sua fonte em um tubo cônico de 50 mL e permita que os vermes se instalem sob a força gravitacional. Aspirar sobrenadante a 5 ml. Ressuspender em um total de 50 mL de S basal.
5. Repita a etapa 1.4 duas vezes.
6. Usando um classificador de minhocas, classifique aproximadamente 22 minhocas em cada poço da placa de 384 poços.
   Nota: A configuração descarta cada verme em ~ 1,1 μL de líquido. 22 vermes totalizarão 25 μL, elevando o volume total do ensaio para 70 μL / poço.
   1. A composição final de cada poço consiste em 70 μL. 45 μL deste volume são adicionados como meio bacteriano (0,03 OD₆₀₀ bactérias em 24 μL S Basal e 21 μL SK suplementado com CaCl₂ e MgSO₄). Os outros 25 μL são adicionados com os 22 vermes.
   2. Se o classificador usado aqui (consulte a Tabela de Materiais) não estiver disponível, os vermes podem ser diluídos até uma concentração final de 1 verme/μL em S Basal e pipetados 25 μL/poço usando uma pipeta multicanal. No entanto, os resultados podem apresentar maior variabilidade. Alternativamente, é possível usar um dispensador de líquido peristáltico, conforme descrito por Leung e colegas.
7. Depois que os vermes forem classificados na placa de 384 poços, sele a placa com um filme permeável a gás e incube as placas a 25 °C por 24 a 48 h.
8. No momento desejado, use uma lavadora de microplacas para lavar a placa de 384 poços com S Basal um total de 5 vezes.
   1. Após a segunda lavagem, aspire a maior parte do meio, deixando ~ 20 μL. Agite vigorosamente as placas usando um vórtice de microplacas por pelo menos 30 segundos para soltar quaisquer detritos do fundo dos poços).
9. Após a lavagem final, aspire o sobrenadante até 20 μL. Adicione 50 μL de corante de ácido nucleico 0,98 μM (consulte a Tabela de Materiais)/poço da placa de 384 poços, para uma concentração final de 0,7 μM.
10. Incubar à temperatura ambiente durante 12 - 16 h. Este corante só mancha vermes mortos. Após o período de incubação desejado, lave as placas usando o lavador de microplacas para remover qualquer excesso de mancha (mínimo de 3 lavagens).
11. Para aquisição de dados, use um espectrofotômetro ou um microscópio automatizado para obter imagens da luz transmitida e da fluorescência (excitação de 531 nm e emissão de 593 nm).

Materiais