Avaliação da mortalidade induzida por bactérias patogênicas em larvas de C. elegans

Resumo

Fonte: Anderson, Q. L., et al. Um patossistema de C. elegans de alto rendimento, alto conteúdo e base líquida. J. Vis. Exp. (2018)

O vídeo demonstra um ensaio em base líquida onde larvas de C. elegans geneticamente modificadas são expostas a bactérias patogênicas em uma microplaca. As toxinas bacterianas secretadas no meio induzem o estresse e a morte do hospedeiro. Um corante fluorescente cora vermes mortos, permitindo a quantificação baseada em imagens da mortalidade para avaliar a suscetibilidade ou resistência genética.

Protocolo

1. Configuração do ensaio de morte líquida (protocolo básico)

Nota: Este é um protocolo para uma cepa bacteriana e uma fonte de vermes.

1. Usando um raspador de células, remova a Pseudomonas aeruginosa de uma placa Slow Killing ou SK e ressuspenda em ~ 5 mL de S Basal. Aumente a escala se necessário. Medir a densidade óptica da suspensão bacteriana com um espectrofotómetro (OD₆₀₀)
2. Preparar 24 ml de massa diluída de P. aeruginosa em S basal a₆₀₀ ≈ 0,09 (concentração final 3X). Consulte 4.6.2 para o conteúdo final por poço e dimensione o volume da diluição bacteriana de acordo.
3. Adicione 21 mL....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
COPAS FP BioSorter	União Biométrica		Citômetro de fluxo de objetos grandes/classificador de vermes
Citação 5	BioTek
Dispensador de lavadora EL406	BioTek
Multitron Pro	Jogadores de Inteligência HT
24 Bloco RB de poço profundo	Thermo Fisher Científico	CS15124
Placa de 384 poços	Greiner Bio-One	MPG-781091
Meios de crescimento de nematóides (NGM)			Quantidade por litro: 18 gramas de ágar, 3 gramas de NaCl, 2,5 gramas de peptona, 1 mL de CaCl₂ (1 M), 1 mL de MgSO₄ (1 M), 25 mL de tampão fosfato e 973 mL de água mili-Q
Placas de eliminação lenta (SK)			Quantidade por litro: 18 gramas de ágar, 3 gramas de NaCl, 3,5 gramas de peptona, 1 mL de CaCl₂ (1 M), 1 mL de MgSO₄ (1 M), 25 mL de tampão fosfato e 973 mL de água mili-Q
Mídia de Slow Killing (SK)			Quantidade por litro: 3 gramas de NaCl, 3,5 gramas de peptona, 1 mL de CaCl₂ (1 M), 1 mL de MgSO₄ (1 M), 25 mL de tampão fosfato e 973 mL de água mili-Q
Caldo de Lisogenia (LB)	Ciências da Vida Radiológicas	L1520
Caldo de infusão de coração Brian (BHI)	Produtos de Pesquisa International Corp	50-488-526
Solução de alvejante de minhoca			Quantidade por 100 mL: 10 mL de solução de NaOH 5 M, 20 mL de solução de hipoclorito de sódio a 5% e 70 mL de água estéril
S Basal			Quantidade por litro: 5,85 gramas de NaCl, 6 gramas de KH₂PO₄, 1 grama de K₂HPO₄ e 1 litro de água mili-Q
Ágar	Ciências da Vida Radiológicas	A0930
NaCl	Ciências da Vida Radiológicas	S5000
Peptona	Ciências da Vida Radiológicas	Pág. 3300
CaCl₂	Ciências da Vida Radiológicas
MgSO₄	Fisher Científico	M63-500
Tampão fosfato			quantidade por litro: 132 mL de K₂HPO₄ (1M) e 868 mL de KH₂PO₄ (1M)
KH₂PO₄	Acros Orgânicos	7778-77-0
K₂HPO₄	Ciências da Vida Radiológicas	Pág. 5100
Solução de hipoclorito de sódio a 5%	BICCA	7495.5-32
Solução de NaOH	Fisher Científico	SS255-1
Respire com facilidade	Biotecnologia diversificada	BEM-1
Mancha de ácido nucleico laranja SYTOX	Fisher Científico	S11368
Cepas bacterianas
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis (OG1RF)
Superalimento de E. coli (OP50)
E. coli Bactérias que expressam RNAi (HT115)
Cepas de vermes
glp-4 (bn2) (Beanan e Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::Repórter GFP (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)