Cultura e manutenção de bactérias que expressam RNAi

Resumo

Fonte: Anderson, Q. L., et al., Um patossistema de C. elegans de alto rendimento, alto conteúdo e base líquida. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a preparação de bactérias de interferência de RNA (RNAi) que transportam plasmídeos para inibir a expressão do gene alvo. Ele descreve as etapas de seleção, crescimento e indução bacteriana de RNAi para produzir placas que expressam dsRNA para ensaios a jusante.

Protocolo

1. Preparação de bactérias de RNA de interferência (RNAi)

1. Risque ou transfira as cepas desejadas de bactérias contendo RNAi para placas de ágar caldo de lisogenia (LB) contendo antibióticos apropriados (carbenicilina a 100 μg / mL e tetraciclina a 15 μg / mL para bibliotecas Ahringer e Vidal) de um estoque congelado.
   Nota: Ao trabalhar com bactérias não patogênicas, use um gabinete de segurança biológica de nível de biossegurança (BSL)-2 A/B ou uma capela de fluxo laminar BSL-1 para garantir a esterilidade das culturas e minimizar a chance de contaminação cruzada da biblioteca.
2. Incubar as placas durante 24 h a 37 °C.
3. Conservar as placas a 4 °C durante um período máximo de duas semanas.
   1. Após duas semanas, descarte os pratos e substitua-os por pratos recém-feitos.
4. Teste várias cepas de RNAi em paralelo, inoculando individualmente uma única colônia de cada clone em 4 mL de LB suplementado com carbenicilina em um único poço de uma placa de poço profundo de 24 poços ou em um tubo de ensaio estéril.  
   Nota: Foi relatado que a tetraciclina reduz a eficiência do RNAi. Não o use neste meio.
5. Coloque as placas de poços profundos de 24 poços em uma incubadora de agitação otimizada para placas multipoços e incube a 37 °C por 16 h enquanto agita a 950 rpm. Nota: É difícil obter um crescimento bacteriano uniforme em placas multipoços usando uma incubadora de agitação convencional. A incubadora vibratória precisa ser capaz de agitar a um mínimo de 750 rpm para que as culturas cresçam adequadamente. Na ausência de um agitador especializado, é possível cultivar cada cultura em um tubo individual. As culturas podem ser transferidas para a placa de 24 poços para centrifugação posterior.
6. Colete as bactérias centrifugando por 5 minutos a 2.000 x g.
7. Transvasar o sobrenadante invertendo a placa e agitando vigorosamente. Ressuspenda as bactérias RNAi em 100 μL de S Basal (5,85 g de cloreto de sódio, NaCl; 1 g de fosfato dipotássico, K₂HPO₄; 6 g de fosfato monopotássico, KH₂PO₄ dissolvido em 1 L de água ultrapura e esterilizado em autoclave).
8. Pipetar bactérias ressuspensas em um número apropriado de poços de uma placa NGM multipoços (meio de crescimento de nematóides, 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona, 1 mM de cloreto de cálcio, CaCl₂; 1 mM de sulfato de magnésio, MgSO₄; 25 mL de tampão fosfato (quantidade por litro: 132 mL de K₂HPO₄ (1 M) e 868 mL de KH₂PO₄ (1M)), e 18 g de ágar por litro de água) suplementado com IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo; concentração final de 1 mM) e carbenicilina (concentração final de 100 μg/mL).
   1. Use 3.5 mL de meio NGM por poço de uma placa de 6 poços, 1 mL por poço de uma placa de 24 poços ou 150 μL por poço de uma placa de 96 poços.
   2. Use 100 μL/poço de bactérias para uma placa de 6 poços, 50 μL/poço para uma placa de 24 poços ou 20 μL/poço para uma placa de 96 poços. Deixe secar.
      Nota: A secagem é normalmente realizada em uma coifa de fluxo estéril para promover uma secagem rápida e uniforme. A secagem uniforme é muito importante. Evite secar demais, pois rachaduras no ágar promovem a escavação de vermes. Isso leva a perdas de vermes e potencial entupimento dos sistemas de manuseio de líquidos.
9. Use as placas preparadas imediatamente ou guarde-as a 4 °C por até duas semanas para uso posterior.
   Nota: Para evitar que as placas sequem, elas podem ser seladas com filme plástico de parafina ou colocadas em um recipiente hermeticamente fechado com toalhas de papel úmidas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bloco RB de 24 poços profundos	Thermo Fisher Científico	CS15124
Meios de crescimento de nematóides (NGM)			Quantidade por litro: 18 gramas de ágar, 3 gramas de cloreto de sódio, 2,5 gramas de peptona, 1 mL de cloreto de cálcio (1 M), 1 mL de sulfato de magnésio (1 M), 25 mL de tampão fosfato e 973 mL de água mili-Q
Caldo de Lisogenia (LB)	Ciências da Vida Radiológicas	L1520
S Basal			Quantidade por litro: 5,85 gramas de cloreto de sódio, 6 gramas de fosfato monopotássico, 1 grama de fosfato dipotássico e 1 litro de água mili-Q
Ágar	Ciências da Vida Radiológicas	A0930
Cloreto de sódio	Ciências da Vida Radiológicas	S5000
Peptona	Ciências da Vida Radiológicas	Pág. 3300
Cloreto de cálcio	Ciências da Vida Radiológicas
Sulfato de magnésio	Fisher Científico	M63-500
Tampão fosfato			Quantidade por litro: 132 mL de fosfato dipotássico (1 M) e 868 mL de fosfato monopotássico (1 M)
Fosfato monopotássico	Acros Orgânicos	7778-77-0
Fosfato dipotássico	Ciências da Vida Radiológicas	Pág. 5100