Expressão do operon de luminescência em bactérias bioluminescentes marinhas

Resumo

Fonte: Brodl, E., et al. In situ Medição e correlação da densidade celular e emissão de luz de bactérias bioluminescentes. J. Vis. Exp. 1 (2018)

Este vídeo demonstra o cultivo de bactérias bioluminescentes marinhas para observar a ativação mediada por quorum sensing do operon de luminescência, permitindo o monitoramento em tempo real da expressão gênica e emissão de luz para estudos em comunicação microbiana e regulação gênica.

Protocolo

1. Expressão de cepas bioluminescentes bacterianas

NOTA: As cepas bioluminescentes bacterianas requerem meio de crescimento específico/meio artificial de água do mar para crescimento e produção de luz.

1. Prepare um meio artificial de água do mar, composto por dois componentes de meio preparados separadamente.
   NOTA: As quantidades a seguir são para 1 L de meio líquido ou 1 L de meio de ágar.
   1. Para o meio artificial de água do mar, pesar os seguintes sais: 28,13 g de NaCl (cloreto de sódio), 0,77 g de KCl (cloreto de potássio), 1,60 g de CaCl₂ · 2H₂O (cloreto de cálcio di-hidratado), 4,80 g de MgCl₂ · 6H₂O (cloreto de magnésio hexa-hidratado), 0,11 g de NaHCO₃ (bicarbonato de sódio) e 3,50 g de MgSO₄ · 7H₂O (sulfato de magnésio hepta-hidratado).
   2. Adicione 1 L de água destilada e dissolva todos os componentes.
   3. Para o meio LB (Luria-Bertani), pesar os seguintes ingredientes: 10 g de extracto de levedura, 10 g de peptona e, para as placas de ágar, mais 20 g de ágar.
   4. Adicione 250 mL de água da torneira e dissolva os componentes.
   5. Autoclave ambos os meios preparados separadamente a 121 °C por 20 min.
   6. Para placas de ágar, combine 250 mL de meio LB com 750 mL de meio artificial de água do mar diretamente após a autoclavagem e prepare as placas.
   7. Para meio líquido, combine 250 mL de meio LB com 750 mL de meio artificial de água do mar diretamente após a autoclavagem ou quando resfriado.
      NOTA: O meio artificial de água do mar pode ficar turvo com a precipitação de sal.
2. Risque as cepas bioluminescentes bacterianas em placas de ágar médio de água do mar artificial e incube durante a noite a 24 - 30 ° C.
   NOTA: O armazenamento a longo prazo de cepas bacterianas é normalmente obtido por meio do congelamento dos estoques de glicerol da cultura bacteriana. As estirpes devem ser sempre riscadas em placas de ágar primeiro para garantir condições de arranque uniformes para todas as estirpes, antes da utilização para culturas líquidas, devido a uma fase de atraso no crescimento após a descongelação.
3. Prepare um ONC (cultura noturna) inoculando 100 mL de meio artificial de água do mar com uma única colônia da placa. Incubar o ONC a 24 - 30 °C e 120 rpm em um agitador de incubadora durante a noite.
4. Inocular 800 mL de meio artificial de água do mar com 8 mL de ONC.
5. Incubar as células bacterianas a 24 - 30 °C e 120 rpm em um agitador de incubadora.
   NOTA: O perfil de intensidade de luz das bactérias bioluminescentes varia fortemente com a temperatura. Dependendo dos mecanismos reguladores da produção de luz da respectiva cepa bacteriana, a emissão de luz pode começar após aproximadamente 1 - 6 h.
6. Observe a cultura de células bacterianas até que elas comecem a brilhar (aproximadamente 1 - 6 h).
   NOTA: Dependendo do objetivo da expressão, as células são cultivadas até o dia seguinte e depois são colhidas, ou as células podem ser mantidas tremendo enquanto estiverem brilhando. A colheita das células e a purificação de quaisquer proteínas podem ser feitas de acordo com os procedimentos padrão.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agitador de incubadora padrão Multitron	Infors AG