Análise microscópica do crescimento bacteriano sob estresse usando câmaras microfluídicas

Resumo

Fonte: Cayron, J., et al. Análise em várias escalas do crescimento bacteriano sob tratamentos de estresse. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra como preparar e usar uma placa microfluídica para obter imagens de células bacterianas sob condições de estresse. Ele descreve o processo de introdução de uma cultura bacteriana e um meio antibiótico indutor de estresse, seguido de carregamento celular e configuração microscópica. A imagem de lapso de tempo no modo de contraste de fase é então usada para observar o desenvolvimento de células filamentosas alongadas com conteúdo de DNA aumentado devido à divisão celular inibida.

Protocolo

1. Imagem microfluídica de microscopia de lapso de tempo
   1. Remova a solução de conservação da placa microfluídica e substitua-a por meio fresco pré-aquecido a 37 °C, conforme descrito no guia do usuário do software microfluídico.
   2. Sele a placa microfluídica no sistema coletor e clique no botão Priming.
   3. Coloque a placa microfluídica com o sistema coletor no microscópio stage e pré-aqueça a 37 ° C por ~ 2 h antes de iniciar a aquisição da microscopia.
      NOTA: Essa etapa de pré-aquecimento é fundamental para evitar a dilatação da câmara microfluídica, o que alteraria o foco do microscópio durante o experimento de lapso de tempo e comprometeria a aquisição da imagem.
   4. Sele a placa microfluídica. Substitua o meio do poço 8 por 150 μL de amostra de cultura e substitua o meio do poço 1 a 5 pelo meio desejado com ou sem o reagente indutor de tensão.
   5. Sele a placa microfluídica e coloque-a no microscópio stage.
   6. No software microfluídico, execute o procedimento de carregamento celular. Verifique se o carregamento das células é satisfatório olhando ao microscópio sob a luz transmitida. Execute o procedimento de carregamento de células uma segunda vez se a densidade de células na câmara for insuficiente.
   7. Realize um foco cuidadoso no modo de luz transmitida e selecione vários campos de visão que mostrem bactérias isoladas. É importante selecionar campos que não estejam superlotados para poder monitorar o crescimento de células isoladas ao longo do tempo (recomenda-se ~ 10–20 células por 100 μm²). Isso também facilitará a detecção de células durante a análise da imagem.
   8. No software microfluídico, clique no botão Criar um protocolo. Programe a injeção de meio de crescimento para 1–2 equivalentes de tempo de geração para permitir que as células se adaptem (opcional). Em seguida, programe a injeção do meio indutor de estresse durante 10 min a 2 psi, seguida de injeção a 1 psi pela duração desejada do tratamento de estresse. Se você pretende analisar a recuperação das células após o estresse, programe a injeção de meio de crescimento fresco pela duração desejada.
      NOTA: No experimento aqui apresentado, a cefalexina foi injetada por 10 min a 2 psi, seguida de 50 min a 1 psi. Em seguida, o meio de crescimento fresco foi injetado a 2 psi por 10 min, seguido por 3 h a 1 psi.
   9. Realize imagens de microscopia no modo de lapso de tempo com 1 quadro a cada 10 minutos usando contraste de fase na luz transmitida e uma fonte de luz de excitação de 560 nm para o sinal mCherry, se necessário.
      NOTA: É importante iniciar a aquisição de imagens microscópicas ao mesmo tempo que o início do protocolo de injeção microfluídica.

Materiais