Avaliação do enxame bacteriano usando uma placa inibidora de gradiente

Resumo

Fonte: Guo, S., et al. Quantificando a motilidade do enxame da superfície bacteriana em placas de gradiente indutor. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra o uso de uma placa de enxame de gradiente de camada dupla para estudar o comportamento do enxame bacteriano sob concentrações variadas de inibidores. Uma placa com um inibidor formador de gradiente na camada inferior é inoculada com bactérias e incubada. As imagens são capturadas em intervalos regulares para analisar o efeito da concentração do inibidor no enxame bacteriano.

Protocolo

1. Preparação de placas de enxame gradiente

1. Preparação do meio de enxame
   NOTA: A concentração de 0,7% (p/v) de ágar do meio de enxame foi utilizada neste protocolo.
   1. Prepare o pó de caldo de lisogenia (LB) com ágar em dois frascos cônicos; cada frasco contém 2 g de triptona, 2 g de cloreto de sódio (NaCl), 1 g de extrato de levedura e 1,4 g de ágar. Adicione água bidestilada (ddH₂O) e agite a suspensão usando uma barra de agitação magnética. Ajuste o volume final para 200 mL adicionando ddH₂O adicional.
   2. Autoclave a solução a 121 °C durante 20 min. Use uma tampa permeável ao ar ou filme de vedação de garrafa com saída de ar.
      NOTA: O ágar se dissolverá quando aquecido na autoclave.
   3. Quando a temperatura cair para 65 °C, misture a solução para garantir a homogeneidade e transfira o meio para uma incubadora ou banho-maria a 65 °C para uso a curto prazo.
2. Preparação do meio de enxame da camada inferior
   NOTA: O meio da camada inferior é a mistura de meio de enxame e soluções de estoque indutor. A formulação das placas de enxame de gradiente indutor é mostrada na Tabela 1.
   1. Prepare uma solução estoque de resveratrol 100 mM dissolvendo 114,12 mg de pó de resveratrol liofilizado em 5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) e armazene a solução a -20 ° C.
   2. Prepare uma solução estoque de arabinose a 20% (p / v) dissolvendo 6 g de pó de arabinose em 30 mL de ddH₂O; aguarde 10-15 min para permitir que a arabinose se dissolva; e armazene a solução em temperatura ambiente.
   3. Retirar o meio da incubadora a 65 °C e colocá-lo à temperatura ambiente; Deixar arrefecer o meio de enxame até que o Erlenmeyer esteja suficientemente frio para conter (~50 °C). Não coloque o meio de enxame em temperatura ambiente por longos períodos, pois isso causará a solidificação do ágar.
   4. Adicionar o volume necessário da solução-mãe indutora ao meio de enxame a 50 °C (quadro 1). Use uma pipeta para dispensar a solução indutora em vez de despejá-la. Agite suavemente para misturar o indutor com o meio de enxame.
      NOTA: Esta etapa é para indutores que não podem ser autoclavados. Tenha cuidado para não introduzir bolhas no meio.
3. Preparação de placas de enxame de gradiente de camada dupla
   NOTA: O meio da camada superior é um meio LB contendo 0,7% (p / v) de ágar.
   1. Rotule as placas de Petri quadradas de 13 x 13 cm com o nome e as cepas do indutor e apoie as placas sobre a borda das tampas (Figura 1B).
   2. Adicionar 40 ml de meio de camada inferior quente (50 °C) utilizando uma pipeta de 50 ml ou um tubo de centrifugação de 50 ml.
      NOTA: Alternativamente, para placas de Petri quadradas de 13 x 13 cm, 40 mL de camada inferior e camada superior são adequados; para placas de Petri quadradas de 10 x 10 cm, a camada inferior de 25 mL e a camada superior são adequadas.
   3. Deixar o meio da camada inferior curar descoberto durante 1 h no interior de uma capela de fluxo laminar. Não perturbe as placas de Petri quadradas enquanto o meio se solidifica.
      NOTA: Durante a cura da camada inferior, o meio de enxame que não contém indutores deve ser mantido em uma incubadora ou banho-maria a 65 °C.
   4. Quando a camada inferior estiver completamente solidificada, remova as tampas e coloque as placas de Petri quadradas dentro de uma capela de fluxo laminar.
   5. Adicione 40 mL de meio de camada superior quente (50 ° C) usando uma pipeta de 50 mL ou tubo de centrífuga de 50 mL.
      NOTA: O meio da camada superior não contém indutores.
   6. Catalise as placas de camada dupla na bancada, cobertas e sem mexer por 1 h. Armazene as placas preparadas a 4 °C por até 24 h.NOTA: Tempos de cura mais longos reduziriam o teor de umidade e restringiriam a motilidade do enxame.

2. Crescimento de E. coli K12 e P. aeruginosa PAO1

1. Prepare 500 mL de meio LB adicionando 5 g de triptona, 5 g de NaCl e 2,5 g de extrato de levedura em ddH₂O e complete a solução para 500 mL. Autoclave a solução no ciclo do líquido durante 20 min a 121 °C e armazene-a a 4 °C.
2. Prepare 100 mL de meio LB-ágar a 1,5% (p / v) adicionando 1 g de triptona, 1 g de NaCl, 0,5 g de extrato de levedura e 1,5 g de ágar em ddH₂O e complete a solução para 100 mL. Autoclave a solução no ciclo líquido durante 20 min a 121 °C. Transferir o meio para um banho-maria a 50 °C para evitar que o ágar solidifique.
3. Quando o balão de meio LB-ágar estiver confortável de segurar, adicione 20 mL de meio LB-ágar em uma placa de Petri (10 cm de diâmetro) usando uma pipeta de 25 mL. Deixe a placa à temperatura ambiente durante a noite e guarde a placa LB-agar a 4 °C.
4. Faça o estoque de culturas armazenadas a -80 ° C, cepas de E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 e P. aeruginosa PAO1-YdeH em placas de Petri de ágar LB usando alças de inoculação descartáveis. Incubar as placas de Petri invertidas durante a noite a 37 °C.
5. Escolha colônias únicas para diferentes cepas das placas de Petri, inocule cada colônia em 5 mL de meio LB e incube a cultura a 37 ° C em um agitador orbital de laboratório ajustado para 220 rpm.
6. Quando a densidade da cultura atingir OD600nm ~ 1,0, remova a cultura do agitador e coloque-a em temperatura ambiente. Ajuste a densidade da cultura para OD600nm = 1.0, conforme descrito na etapa 3.2.1.

3. Inoculação e incubação de placas de enxame de gradiente

1. Preparação de poços de inoculação
   NOTA: Modelos de tampa de impressão 3D capazes de gerar poços separados por uma distância padrão podem ser usados em vez do método descrito abaixo.
   1. Marque as posições dos poços em papel A4, conforme mostrado na Figura 1C. Definir três concentrações de ensaio numa placa de Petri quadrada com duas ou três réplicas.
   2. Coloque o papel A4 marcado sob uma placa de gradiente solidificada. Empurre o lado mais largo de uma ponteira de pipeta de 100 μL para a superfície do meio semissólido na posição marcada. Pressione a ponta da pipeta até atingir a parte inferior do meio da camada superior.
   3. Quando a ponta tocar o fundo, não aplique força vertical na ponta; Gire suavemente a ponta para isolar o conteúdo do poço cilíndrico.
   4. Mova horizontalmente as pontas da pipeta ao longo de uma distância muito pequena para permitir o fluxo de ar para o espaço estreito reservado. Pressione a ponta com o dedo indicador para bloquear o fluxo de gás dentro da ponta enquanto segura a pipeta usando o polegar e o dedo médio.
   5. Puxe a ponta verticalmente, mantendo o conteúdo do poço na ponta enquanto a puxa para fora.
      NOTA: Se o conteúdo do poço escorregar, aplique um pouco mais de pressão com o dedo indicador para selar completamente a ponta.
   6. Repita os passos 3.1.2 a 3.1.5 em todas as posições marcadas. Cubra a placa de enxame antes da inoculação.
2. Inoculação e incubação de placas de gradiente
   1. Ajuste a densidade da cultura de crescimento noturno para OD600nm = 1,0.
   2. Pipete 80 μL da cultura de crescimento noturno em cada poço. Não derrame a cultura bacteriana fora dos poços.
   3. Enrole as placas com filme de vedação. Para observação de longo prazo (3-5 dias), enrole as placas com fita de borracha de laboratório estéril.
      NOTA: A fita de borracha tem menos probabilidade de quebrar.
   4. Coloque um copo cheio de ddH₂O na incubadora para manter a umidade dentro da incubadora. Incubar as placas de enxame gradiente a 37 °C.
      NOTA: Não incube as placas de enxame de cabeça para baixo; Isso fará com que a cultura bacteriana vaze dos poços.
   5. Fotografe a placa de enxame imediatamente após a inoculação, registrando-a como o ponto de tempo de 0 h.

4. Imagem de enxame de superfície bacteriana

1. Retire as placas de enxame, uma de cada vez, da incubadora a cada 12 h, segurando a placa horizontalmente, e coloque-as no sistema de imagem em gel (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Não deixe impressões digitais na superfície das placas; Segure a lateral da placa de enxame com luvas limpas.
2. Selecione o modo de imagem em gel ; exponha a placa de enxame à luz branca; e ajuste a distância focal para dar a visão mais clara dos enxames.
   NOTA: Use a mesma distância focal para todas as placas em um determinado lote.
3. Aumente o brilho dos enxames para uma observação nítida, ajustando o tempo de exposição para 300 ms. Ajuste o limite para minimizar a interferência da luz de fundo.
   NOTA: O limite é ajustado na interface operacional do sistema de imagem de gel. Aumente os valores à esquerda para minimizar a interferência da luz de fundo; Diminua os valores à direita para aumentar o brilho dos enxames. Neste protocolo, a região costuma estar entre 6.000 e 50.000.
4. Salve o arquivo de imagem para análise posterior. Registre o tempo de imagem, o tipo de indutor, a orientação do gradiente e as deformações em um arquivo .txt .

 

Tabela 1: Especificações do meio de enxame de camada dupla.

Meio de camada superior/meio de caldo de lisogenia (por 100 mL)
Triptona: 1 g
Cloreto de sódio: 1 g
Extrato de levedura: 0,5 g
Ágar: 0,7 g
Meio da camada inferior/meio contendo indutor (por 100 mL)
Triptona: 1 g	Concentração de trabalho:	Concentração da solução de estoque:
Cloreto de sódio: 1 g
Extrato de levedura: 0,5 g	- Resveratrol: 400 μM	- Resveratrol: 100 mM
Ágar: 0,7 g
Indutor:	- Arabinose: 0,5% (p / v)	- Arabinose: 20% (p/v)
- Solução estoque de resveratrol: 400 μL	ou 1% (p/v)
- Solução estoque de arabinose: 2,5 mL ou 5 mL

Resultados

Figura 1: Esquema da preparação, inoculação e incubação da placa de enxame de gradiente indutor. (A) Crescimento noturno da cultura bacteriana a 37 °C. (B) Fluxo de trabalho da placa de enxame de gradiente indutor de camada dupla. i) Apoie p...

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