Detecção colorimétrica da degradação do córtex durante a germinação de esporos bacterianos

Resumo

Fonte: Francis, M. B., et al. Detecção de fragmentos de córtex durante a germinação de esporos bacterianos. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra um método colorimétrico para detectar a degradação do córtex durante a germinação de esporos bacterianos, medindo a liberação de açúcares redutores ao longo do tempo. Usando padrões de N-acetilglucosamina e amostras de ponto de tempo, o ensaio quantifica a concentração de açúcar por meio de uma reação cromogênica roxa, indicando a extensão da hidrólise do córtex.

Protocolo

1. Reagente de cor

1. Enquanto as amostras estão no gelo, prepare o reagente de cor. Dissolver 0,320 g de p-dimetilaminobenzaldeído (DMAB; Reagente de Ehrlich) em 1,9 ml de ácido acético glacial.
   Nota: O reagente é sensível ao tempo, à temperatura e à luz e não deve ser feito com antecedência.
2. Depois que o DMAB se dissolver completamente, adicione 100 μl de HCl 10 N e vórtice.
3. Adicione 5 ml de ácido acético glacial e vórtice.

2. Reação Colorimétrica

1. Transfira 100 μl de cada amostra de córtex resfriado para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Adicionar 700 μl da solução corante recém-preparada a cada amostra.
3. Transfira imediatamente as amostras para um banho-maria a 37 °C e incube por EXATAMENTE 20 min.
4. Transfira 200 μl de cada amostra para uma placa transparente de 96 poços.
5. Quantificar as amostras a 585 nm num leitor de placas. As amostras devem começar com uma cor amarela e uma reação positiva mudará para roxo. Quanto mais córtex presente, mais profunda é a cor roxa.

Materiais