Produção e recuperação de proteínas recombinantes de vesículas derivadas de bactérias

Resumo

Fonte: Streather, B. R., et al. Produção e análise otimizadas de vesículas cheias de proteínas recombinantes de E. coli. J. Vis. Exp. (2023)

Este vídeo demonstra a produção e o isolamento de proteínas recombinantes marcadas com Peptídeo Nucleante de Vesículas (VNp) de vesículas bacterianas. Um indutor desencadeia a expressão de proteínas marcadas com VNp, impulsionando a formação e encapsulamento de vesículas, seguido de centrifugação e sonicação para recuperação eficiente de proteínas sem lise celular

Protocolo

1. Cultura de células bacterianas e indução de proteínas

1. Para induzir a expressão de proteínas recombinantes do promotor T7, adicione isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) a uma concentração final de até 20 μg/mL (84 μM). A indução da expressão de proteínas recombinantes deve ocorrer na fase logarítmica tardia (ou seja, densidade óptica típica, OD₆₀₀ de 0,8-1,0) para a produção de vesículas. ​
   NOTA: A duração do período de indução pode diferir entre as proteínas, com algumas atingindo a produção máxima em 4 h e outras durante a noite (18 h). Até o momento, a exportação máxima de vesículas foi obtida em culturas noturnas.

2. Isolamento de vesículas recombinantes

1. Pulverizar as células por centrifugação a 3.000 x g (4 °C) durante 20 min.
2. Para esterilizar meios contendo vesículas para armazenamento de longo prazo, passe o meio de cultura limpo por um filtro de polietersulfona (PES) estéril e sem detergente.
   NOTA: Para testar a exclusão de células viáveis do filtrado contendo vesículas, colocar em ágar caldo de lisogenia (LB) e incubar durante a noite a 37 °C.
3. Para concentrar as vesículas em um volume menor, passe o meio estéril contendo vesículas por um filtro estéril e sem detergente de 0,1 μm de ésteres de celulose mista (MCE).
4. Lave suavemente a membrana com 0,5-1 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) usando um raspador de células ou espalhador de plástico para remover cuidadosamente as vesículas da membrana. Transfira para um novo tubo de microcentrífugas. ​
   NOTA: As vesículas purificadas podem ser armazenadas em meios estéreis ou PBS a 4 °C. Existem exemplos de proteínas recombinantes armazenadas nessas vesículas por 6 meses, desta forma, sem perda de atividade enzimática.

3. Liberação de proteína solúvel de vesículas isoladas

1. Uma vez que as vesículas contendo proteínas tenham sido isoladas no meio/tampão estéril, submeta as membranas lipídicas vesiculares à sonicação usando um cronograma apropriado para o aparelho (por exemplo, ciclos de ligar e desligar 6x 20 s) e centrifugue a 39.000 x g (4 °C) por 20 min para remover os detritos da vesícula. NOTA: O choque osmótico ou o tratamento com detergente podem ser usados como uma alternativa para abrir as vesículas, mas deve-se considerar o impacto na funcionalidade da proteína e/ou na aplicação a jusante.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
β-D-1-tiogalactopiranosídeo isopropílico (IPTG)	Melford	367-93-1
Caldo de Lisogenia (LB) / Ágar LB	Estoque de laboratório	NA	10 g/L de triptona; 10 g/L de NaCl; 5 g/L de extrato de levedura (1,5 g/L de ágar)
Filtro de membrana MF-Millipore (0,1 μm, MCE)	Merck	VCWP04700
Filtro de membrana Millipore Express PLUS (0,45 μm, PES)	Merck	HPWP04700
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Estoque de laboratório	NA