Transferência de plasmídeo F e seleção dupla de antibióticos em E. coli

Resumo

Fonte: Erdogan, F., et al., Ensaios de acasalamento conjugativo para análise específica de sequência de proteínas de transferência envolvidas na conjugação bacteriana. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o procedimento para transferir um plasmídeo F do doador para as células de E. coli receptoras usando um plasmídeo de resgate e selecionando transconjugantes por meio de resistência dupla a antibióticos. O processo inclui a mistura de culturas bacterianas, incubação sem agitação, interrupção de pares de acasalamento e plaqueamento em meio seletivo para confirmar a transferência de plasmídeo bem-sucedida.

Protocolo

1. Ensaio de acasalamento conjugativo de doadores XK1200 para receptores MC4100

1. Preparar uma cultura O/N de células XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gene em 20 ml de caldo de lisogenia estéril (LB) com 20 μg/ml de cloranfenicol (Cm), 50 μg/ml de canamicina (Km) e células MC4100 em 5 ml de LB com 50 μg/ml de estreptomicina (Sm) utilizando células de uma reserva de glicerol ou de uma única colónia numa placa de ágar e numa pipeta ou alça estéril. Cultive culturas a 37 °C com agitação de 200 rpm.
2. Faça diluições 1:70 de cada cultura O/N separadamente em 2 mL de LB estéril com os mesmos antibióticos. Adicionar glicose a uma concentração final de 100 mM a todas as células doadoras. Cultive as células até a fase intermediária (OD₆₀₀ 0,5-0,7) a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
3. Centrifugue (4.000 x g por 5 min a 4 ° C) para pellet células, descarte o sobrenadante, lave uma vez com LB estéril frio para remover antibióticos e ressuspenda as células em 2 mL de LB estéril frio.
4. Em duplicado, alíquota de 100 μl de cada cultura em 800 μl de meio LB estéril e deixe-os acasalar a 37 °C por 1 h sem agitação.
5. Vortex as células por 30 s para interromper os pares de acasalamento e coloque-as no gelo por 10 min para evitar mais acasalamento.
6. Usando a mistura em vórtice e LB estéril fresco, prepare 6 diluições (^10-2 a ^10-7) dos transconjugantes. Selecione para as células transconjugante MC4100 pOX38-Tc Δgene::Cm identificando alíquotas de 10 μL de cada diluição em cada metade das placas de ágar contendo 50 μg/mL Sm e 20 μg/mL Cm, como na Figura 1. Repita para ambas as misturas duplicadas. Mantenha a área estéril e trabalhe perto de uma chama. Incubar as placas O/N a 37 °C.

Resultados

Figura 1: Ensaio de acasalamento para avaliar a função do gene alvo na conjugação. As células doadoras e receptoras foram E. coli XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cm transformada com pK184-TraF e MC4100, respectivamente....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Petri	Fisher Científico	FB0875713
Antibióticos			Concentrações Finais
Cloranfenicol (cm)	Fisher Científico	BP904-100	20 μg/mL
Canamicina (km)	BioBasic Inc.	DB0286	50 μg/mL
Estreptomicina (Sm)	Fisher Científico	BP910-50	50 μg/mL