Inativação de bactérias usando mononucleotídeo de flavina ativado por luz

Resumo

Fonte: Cheng, C., et al. Inativação de patógenos via fotólise de luz visível de riboflavina-5'-fosfato. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra um método para avaliar os efeitos fototóxicos do mononucleotídeo de flavina (FMN) em bactérias patogênicas. As culturas bacterianas são expostas a concentrações crescentes de FMN e iluminadas com luz visível para gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) que danificam os componentes celulares. As bactérias sobreviventes são então quantificadas para avaliar a redução da viabilidade dependente da dose.

Protocolo

1. Viabilidade de Staphylococcus aureus (S. aureus) após fotólise de FMN (Figura 1)
   1. Transmita uma colônia de S. aureus (BCRC 10451) de uma placa cultivada para 10 mL de caldo de lisogenia tomado em um tubo de ensaio com tampa de rosca de 15 mL. Cultura em shaker a 37°C durante 16 h.
   2. Transfira 0,5 mL da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Adicione água esterilizada no tubo de centrífuga para diluir a cultura a uma densidade óptica de 0,5 a 600 nm (OD₆₀₀) (~ 6 x 10⁷ unidade formadora de colônias [UFC] / mL).
   3. Transfira 0,5 mL da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mL, centrifugue a 14.000 x g por 10 min e transvase o sobrenadante para obter um pellet celular.
   4. Adicione 1 mL de riboflavina-5'-fosfato (ou mononucleotídeo de flavina; FMN) (30, 60 e 120 μM FMN em tampão fosfato de potássio [PB]) para os pellets celulares obtidos como na etapa 1.3 e vórtice. Para controle irradiado, adicione 1 mL de PB sozinho.
   5. Transfira 1 mL de cada uma das soluções de células bacterianas viáveis contendo 30 μM de FMN e PB sozinhos para tubos de vidro e irradie-os com luz violeta a 10 W / m² por 30 min.
   6. Transfira 1 mL de cada uma das soluções de células bacterianas viáveis contendo 30, 60 e 120 μM de FMN e PB sozinhos para tubos de vidro e irradie-os com luz azul a 20 W / m² por 120 min. Configure outro tubo de vidro com 1 mL de solução de células bacterianas viáveis contendo 120 μM de FMN e irradie-o com luz azul a 20 W / m² por 60 min.
   7. Configure os tubos de ensaio conforme descrito nas etapas 1.5 e 1.6 e cubra-os com papel alumínio grosso. Esses tubos servem como controles escuros.
   8. Manter a câmara de irradiação (bem como os controlos escuros) numa câmara frigorífica a 9 ± 1 °C durante o período de irradiação de 30-120 minutos.
      NOTA: O calor liberado pelas luzes de diodo emissor de luz (LED) não pode ser ignorado, pois os chips de LED colocados dentro do copo podem aquecer o sistema de fotorreação durante os experimentos de irradiação. Os experimentos foram, portanto, conduzidos em câmara fria mantida a 9 ± 1 °C.
   9. Após a irradiação, transfira 0,2 mL de cada uma das soluções de reação para uma placa de ágar Luria (LA). Espalhar as bactérias sobre a placa com uma vareta de vidro em forma de L e incubar durante a noite a 37 °C.
   10. Calcule a contagem de placas viáveis e as taxas de inativação de S. aureus após o crescimento noturno.

NOTA: A taxa de inativação de S. aureus é calculada como a redução percentual, que é igual a [1 -I / D] ×100%, onde I e D denotam, respectivamente, o número de UFC na amostra irradiada e no controle escuro. A redução percentual é definida como um valor negativo da taxa de inativação.

Resultados

Figura 1: Efeito da fotólise FMN na viabilidade de S. aureus . A redução percentual é definida como um valor negativo da taxa de inativação para S. aureus tratado com (A) FMN sob irra...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Luzes LED azuis, verdes e vermelhas	Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan		DC 12 V 5050
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
Termômetro infravermelho	Raytek Co. Santa Cruz, CA	MT4
LB caldo	Fornecedor:Difco Co., NJ
L-Metionina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
NBT	Bio Basic, Inc. Markham, Ontário, Canadá
Fonte de alimentação	China tech Co., Nova Cidade de Taipei, Taiwan	YP30-3-2
5′-fosfato de riboflavina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R7774
RNase	New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Medidor de energia solar	Eletrônica Co. de Tenmars, Taipei, Formosa	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Centro de Pesquisa e Coleta de Biorrecursos (BCRC), Hsinchu, Taiwan	10451
Espectrômetro óptico UV-Vis	Ocean Optics, Dunedin, Flórida	USB4000
Espectrofotômetro UV-Vis	Hitachi High-Tech Science Corporation, Tóquio, Japão	U-2900
LED violeta	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China