Quantificação da inativação bacteriana induzida por luz através da geração de espécies reativas de oxigênio

Resumo

Fonte: Cheng, C., et al. Inativação de patógenos via fotólise de luz visível de riboflavina-5'-fosfato. J. Vis. Exp. (2022).

Neste vídeo, uma mistura de reação tamponada contendo L-metionina, nitro azul de tetrazólio (NBT) e mononucleotídeo de flavina (FMN) é irradiada com luz violeta para induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Isso leva à inativação bacteriana e à formação de formazan detectável espectrometricamente.

Protocolo

1. Detecção de Espécies Reativas de Oxigênio (O₂•⁻) em Staphylococcus aureus

1. Preparar as amostras de Staphylococcus aureus .
2. Diluir a densidade bacteriana das amostras com água esterilizada até uma densidade óptica de 0,5 a 600 nm (OD (densidade óptica) ₆₀₀, ~ 6 x 10⁶ UFC (unidade formadora de colônias) / mL). Transfira 0,5 mL da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Centrifugue a 14.000 x g por 10 min e decanta o sobrenadante para obter um pellet de célula.
3. Adicione 0,1093 g de L-metionina, 0,1 g de NBT (cloreto de nitro azul de tetrazólio) e 25 mL de FMN (mononucleotídeo de flavina) (400, 240 ou 120 μM) a 75 mL de PB (tampão fosfato). Para cada 1 mL do reagente aplicado, as concentrações finais de FMN, metionina e NBT são 100 (60 ou 30) × ^10-6 M, 7,3 × ^10-3 M e 1,2 × ^10-3 M, respectivamente.
4. Adicione 1 mL de cada solução reagente (ou seja, com concentrações variáveis de FMN) aos pellets celulares obtidos. Irradiar as soluções por luz violeta a 10 W/^m2 durante 10 min.
5. Centrifugue a mistura a 14.000 x g por 10 min e transvase o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para extrair o NBT reduzido. Detectar as espécies de O₂•⁻ produzidas a partir da absorbância a 560 nm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
Termômetro infravermelho	Raytek Co. Santa Cruz, CA	MT4
LB caldo	Fornecedor:Difco Co., NJ
L-Metionina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
NBT (nitro cloreto de tetrazólio azul)	Bio Basic, Inc. Markham, Ontário, Canadá
Fonte de alimentação	China tech Co., Nova Cidade de Taipei, Taiwan	YP30-3-2
5′-fosfato de riboflavina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R7774
Medidor de energia solar	Eletrônica Co. de Tenmars, Taipei, Formosa	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Centro de Pesquisa e Coleta de Biorrecursos (BCRC), Hsinchu, Taiwan	10451
Espectrômetro óptico UV-Vis	Ocean Optics, Dunedin, Flórida	USB4000
Espectrofotômetro UV-Vis	Hitachi High-Tech Science Corporation, Tóquio, Japão	U-2900
LED violeta	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China