Determinando a eficácia antibacteriana de uma tira polimérica carregada de antibióticos

Resumo

Fonte: Sekar, A., et. al., Um novo método para determinar a atividade antibacteriana longitudinal de materiais farmacológicos. J. Vis. Exp. (2023)

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em luminescência para avaliar a eficácia antibacteriana de uma tira polimérica carregada de antibióticos, quantificando a luminescência acionada por ATP, que diminui em culturas bacterianas expostas ao antibiótico.

Protocolo

Configuração do estudo de atividade antibacteriana dependente do tempo

1. Cultive a bactéria durante a noite em 1 mL de caldo TSB (caldo de soja tríptico).
2. Diluir a suspensão bacteriana cultivada durante a noite para 10⁵ UFC/ml em MHB estéril (caldo Mueller-Hinton) e verificar a contagem bacteriana viável utilizando as unidades de luminescência antes de iniciar a experiência.
3. Coloque o UHMWPE virgem (polietileno de ultra-alto peso molecular) e as tiras de UHMWPE carregadas com medicamentos (3 mm x 5 mm x 10 mm) dentro de uma seringa de 3 mL.
4. Aspire MHB contendo 10⁵ UFC/mL para a seringa através da agulha acoplada até a marca de 1,5 mL, o que equivale a 1,35 mL de MHB (Figura 1: Etapa 1).
5. Coloque a configuração da seringa em uma incubadora agitável (100 rpm) a 37 °C até os pontos de tempo indicados: 6 h, Dia 1, Dia 2, Dia 3, Dia 4, Dia 5, Dia 6 e Dia 7 (Figura 1: Etapa 2).
6. Em cada ponto de tempo indicado, retire a configuração da seringa e realize um ensaio de viabilidade microbiana em tempo real em 100 μL de suspensão bacteriana (Figura 1: Etapa 3-4).
   1. Realize o ensaio baseado em luminescência usando placas brancas de 96 poços de fundo opaco.
   2. Misture 100 μL de suspensões bacterianas diluídas com 100 μL de reagente de ensaio.
   3. Coloque uma tampa coberta com papel alumínio sobre a placa de 96 poços preparada e incube por 5 minutos a 100 rpm agitando.
   4. Meça a luminescência imediatamente com um leitor de microplacas usando as seguintes configurações no software Gen5 3.11.
      1. Clique em Novo para configurar um protocolo na janela do Gerenciador de Tarefas .
      2. Selecione Costar 96 branco opaco no menu suspenso para Tipo de placa.
      3. Clique em Ler no menu Selecionar etapas > ações .
      4. Clique em Luminescência na janela Método de leitura. Mantenha as opções de fibra Endpoint/cinética e Luminescência selecionadas em tipo de leitura e tipo óptico, respectivamente. Clique em OK.
      5. Mantenha as configurações na janela Etapa de leitura (ganho = 135; tempo de integração = 1 seg; altura de leitura = 4,5 mm). Clique em OK.
      6. A janela de layout da placa aparece pronta para a execução. Marque a caixa Usar tampa na janela da placa de carga e clique em OK.
      7. Coloque a placa de 96 poços na máquina para ler os valores de luminescência.
7. Determine a contagem de bactérias viáveis para os pontos de tempo de 6 h, Dia 1, Dia 2, Dia 3 e Dia 7. Determine as UFC (unidades formadoras de colónias)/ml a partir das unidades de luminescência utilizando a curva padrão correspondente.
8. Verificar a ausência de bactérias viáveis nas amostras que apresentaram valores de luminescência abaixo do limite de detecção, realizando o método de espalhamento em placas TSA (Tryptic soy agar) e incubando a 35 °C durante a noite. Verifique a presença de colônias no dia seguinte.
9. Centrifugue a suspensão bacteriana restante a 10.000 × g por 10 min e aspire suavemente o meio gasto. Para tubos nos quais os pellets não são observados visualmente devido à atividade antibacteriana dos medicamentos, deixe 100 μL no tubo para garantir que o pellet invisível não seja perturbado (Figura 1: Etapa 5).
10. Ressuspenda as bactérias peletizadas em MHB fresco e retire a suspensão bacteriana para a mesma configuração de seringa através da agulha anexada (Figura 1: Etapa 6).

Resultados

Figura 1: Uma representação esquemática da configuração experimental.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ATCC 12600	Coleção de cultura de tipo americano, VA, EUA
BacTiter-Glo Ensaio de Viabilidade de Células Microbianas	Promega Corporation, EUA	G8231
Caldo de soja BD Bacto Tryptic (meio de digestão de caseína de soja)	Becton-Dickinson, EUA	BD 211825	Comprado da Fisher Scientific, EUA
Seringa BD Luer-Lok estéril, uso único, 3 mL	BD, EUA	309657
Agulha BD 5/8 pol. descartável, estéril, 25 G	BD, EUA	305122
Meios de cultura desidratados BD BBL: Caldo Mueller Hinton II (ajustado a cátions)	Becton-Dickinson, EUA	B12322	Comprado da Fisher Scientific, EUA
Meios de cultura desidratados BD Difco: ágar soja tríptica (ágar Soybean-Caseína Digest)	Becton-Dickinson, EUA	DF0369-17-6	Comprado da Fisher Scientific, EUA
Sulfato de gentamicina	Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China
Incubadora de bancada LSE	Corning, NY, EUA
Leitor de placas (Synergy H1	Biotek, VT, EUA
Agitador Innova 2100	New Brunswick Scientific, NJ, EUA
UHMWPE	GUR1020, Celanese, TX, EUA
Cloridrato de vancomicina	Fagron, Países Baixos	804148