Padronização microfluídica e rastreamento baseado em fluorescência do crescimento bacteriano de célula única

Neste artigo

Resumo

Fonte: Pioli, R., et al., Padronização de microrganismos e micropartículas por meio de montagem assistida por capilaridade sequencial. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o método de captura de células únicas de Escherichia coli (E. coli) marcadas com fluorescência em armadilhas microfluídicas usando uma suspensão livre de carbono e fluxo controlado, seguido de adição de nutrientes para desencadear o crescimento e a imagem de fluorescência de microcolônias.

Protocolo

1. Padrão bacteriano

Um dia antes do experimento, aumente uma população de Escherichia coli (cepa MG1655 prpsM-GFP). Inocular a cultura directamente do material congelado e crescer durante a noite durante 20 h em meio de caldo de lisogenia (LB) numa incubadora agitadora a 37 °C. Adicionar 50 μg/ml de canamicina para que as células retenham o plasmídeo prpsM-GFP (proteína fluorescente verde).
No dia do experimento, ajuste a incubadora de caixas (Figura 1A) a 37 ° C várias horas antes do experimento para garantir uma temperatura uniforme e estável antes de começar. Em seguida, coloque a bomba de seringa e a placa de vidro aquecida no microscópio stagestage (Figura 1B,C), ajustando a temperatura na mesma temperatura da incubadora de caixa.
NOTA: A incubadora de caixa na qual todo o sistema, incluindo o microscópio (Figura 1E), é fechado garante que uma temperatura uniforme e constante seja mantida durante todo o experimento quando o canal é lavado com meio.
Noventa minutos antes do experimento, coloque o chip microfluídico em um recipiente cheio de etanol 100% (EtOH) e lave o canal com 100% de EtOH por pelo menos 10 min. Coloque o chip microfluídico em um dessecador a vácuo e desgaseifique por pelo menos 30 min. Troque o EtOH por água destilada e trate o chip a vácuo por pelo menos 30 min. Coloque o chip microfluídico no forno a 70 °C por 10 min para remover quaisquer vestígios de líquido deixados no canal.
NOTA: Esta etapa é necessária para evitar a formação de bolhas no canal quando lavado com meio de cultura.
Pipete 1 mL de meio de ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico (MOPS) (1x) em um frasco para centrífuga e adicione 10 μL de fosfato de potássio 0,132 M (K₂HPO₄). Retirar a cultura durante a noite da incubadora a 37 °C e alíquota de 100 μL para o frasco da centrífuga e centrifugar a cultura a 2.300 × g por 2 min. Pipete suavemente o sobrenadante para fora dos frascos de centrífuga e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio MOPS fresco com 0,015% v / v de Tween 20 e 0,01% v / v de fosfato de potássio.
NOTA: A concentração típica da suspensão bacteriana está na faixa de 0,015-0,15 vol%, o que garante a formação de uma zona de acumulação estendida e móvel e evita o acúmulo de partículas no substrato. Substituir o meio noturno por meio novo minimiza o risco de liberação de películas de bactérias no modelo. A falta de uma fonte de carbono no meio fresco impede que as células cresçam na suspensão durante a padronização do modelo. Uma concentração de 0,015% v/v de Tween 20 na suspensão é necessária para que o ângulo de contato do líquido recuado no gabarito PDMS caia dentro da faixa ideal, entre 30 e 60°.
Carregue a suspensão bacteriana em uma seringa de 1 mL e conecte a seringa ao chip por meio de um tubo microfluídico.
1. Para garantir a conexão entre a seringa e o tubo, insira diretamente uma agulha com um diâmetro externo de 0.6 mm no tubo. Para evitar espalhar qualquer suspensão remanescente nas proximidades da entrada através do canal, lave o meio fresco através do orifício usado como saída durante o processo de padronização ( Figura 2A-III ), em vez do orifício usado como entrada.
2. Monte a seringa na bomba da seringa e injete a suspensão no chip microfluídico através da entrada localizada na parte a montante do canal até que a suspensão cubra a região do molde com armadilhas. NOTA: Durante o processo de injeção de líquido, o ar pode escapar por uma saída localizada na extremidade a jusante do canal.
3. Ajuste a bomba de seringa para retirar a suspensão bacteriana ( Figura 2A-I ) a uma taxa de fluxo de 0,07-0,2 μL / min, que na geometria descrita corresponde a uma velocidade de recuo do menisco de 80-100 μm / min.
4. Monitore o processo de padronização por meio do software do microscópio.
  NOTA: Aqui, uma ampliação de 10x foi usada para monitorar o menisco recuado no molde e uma ampliação de 20x foi usada para monitorar a deposição de bactérias individuais nas armadilhas microfabricadas.
Uma vez que o molde tenha sido padronizado com células (Figura 2A-II), aumente a taxa de fluxo de retirada para esvaziar rapidamente o canal microfluídico e lave-o com LB fresco que foi previamente desgaseificado por pelo menos 30 min e pré-aquecido a 30 ° C.
Defina a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 2 μL/min para lavar suavemente o canal. Uma vez preenchido o canal, aumentar a vazão (15 μL/min) de acordo com as necessidades experimentais específicas.
Adquira imagens de bactérias em crescimento na ampliação e intervalo de tempo desejados.

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Resultados

Figura 1: Esquema da plataforma para montagem assistida por capilaridade sequencial em um canal microfluídico. (A) Incubadora de caixas. A incubadora de caixas mantém uma temperatura uniforme e constante (aqui, 30 °C) dentro do canal microfl...